In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
لسنوات عديدة، وقد ركزت الأبحاث على الظروف العصبية مثل السكتة الدماغية أو إصابات في الدماغ على تطوير علاجات اعصاب التي تهدف إلى تعزيز بقاء الخلايا العصبية في مرحلة السكتة الدماغية الحادة. الغالبية العظمى من العلاجات المخدرات التي تم العثور عليها لتكون فعالة في نماذج القوارض فشلت عندما تترجم إلى العيادة. وتشمل أسباب هذا الفشل العلاجي ولكن لا تقتصر على عدم وجود آثار المخدرات متواصلة مما أدى إلى استمرار الانتعاش عصبي وظيفي. وبالتالي فمن المهم وضع استراتيجيات تعمل على إعادة تشكيل الدماغ على المدى الطويل. لأن تعزيز بقاء الخلايا العصبية وحدها ليست كافية للسماح ناجح الانتعاش السكتة الدماغية، كما اقترح عدد كبير من التجارب غير الناجحة العصبية، وتحفيز اللدونة العصبية قد تم الحصول عليها مؤخرا مصلحة كبرى في هذا المجال.
يعني لتسليم المخدرات هي حقن داخل الصفاق، وذيل ط داخل الأوعية الدمويةnjection، حقن الفخذ، حقن المجسم واحدة من ناقلات في الدماغ واصل تسليم المستمر بواسطة مضخات miniosmotic. هذا الأخير يمكن أن تشمل تسليم النظامية، وإذا لم يكن لمضخة قنية، أو التي يمكن أن جهاز توجيه، كما بينا للتسليم في الدماغ. باستثناء مضخات miniosmotic واستخدام ناقلات فيروسية، وجميع استراتيجيات أخرى لحث تركيزات المخدرات المتقلبة. لإجراء التجارب على المدى الطويل وبالتالي يصبح من الضروري أن يقدم الحيوان إلى الضغط من تلقي الحقن المتكررة. وBBB يفرض عائقا هاما للامتصاص الدماغ للبروتينات أو المخدرات من الدم، مما أدى إلى الحاجة لكبيرة من البروتين أو المخدرات جرعات من أجل تحقيق تركيزات العلاجية في الدماغ. على سبيل المثال بيليجريني وآخرون (2013) 5 تسليمها rhEpo عن طريق الحقن داخل الصفاق بجرعة أي ما يعادل 75 وحدة دولية / يوم للحيوان من 30 غرام (750 وحدة دولية / يوم لمدة 300 غرام الفئران). وبالمقارنة، فإن تسليم rhEp المستهدفةس إلى الدماغ يسمح لنا باستخدام جرعة أقل بكثير من فقط 10 وحدة دولية / يوم في دراستنا لنجاح الانتعاش السكتة الدماغية، والتي مكنتنا من تحقيق الانتعاش خلال فترة زمنية كبيرة بسعر ثابت من 0.25 ميكرولتر / ساعة.
في هذا العمل أظهرنا طريقة زرع minipumps مع قنية متصلة الجمجمة من أجل تقديم البروتين تعزيز مرونة rhEpo مباشرة إلى البطين، وبالتالي الالتفاف على BBB. بهذه الطريقة، وروجت rhEpo الانتعاش العصبية في عدد من الطرق، بما في ذلك الحد من حجم احتشاء، والحد من تشكيل ندبة الدبقية وتحريض الأوعية الدموية. كما عزز rhEpo بقاء الخلايا العصبية وزيادة التوقعات من القشرة الحركية contralesional نحو النواة الحمراء مزالة العصب والنوى الوجه. تم الكشف عن البكتيريا من الألياف عن طريق الحقن من التتبع تقدمي المسالك BDA في القشرة الحركية (أرقام 4A و 5A). والمتعلقات وظيفية لتنتشر من الألياف هو العلاقات العامةovided من تحسين المهارات الحركية (الشكل 5B). بالإضافة إلى ذلك، لقد أظهرنا أن النهج نفسه لحقن الجهاز التتبع يمكن تطبيقها على كشف النقاب عن اتصالات-المهادي القشري عن طريق الحقن من الوراء المسالك التتبع FG (الشكل 6B).
في إعداد المضخة miniosmotic، فمن الأهمية بمكان أن ينظر في نقطة الهدف واستخدام الفواصل. نحن نستخدم هل احد للحد من طول الإبرة من قبل 0.5MM كما في هذه الطريقة غيض جدا من الإبرة على اتصال مع البطين في إحداثيات معينة (-0.2 مم الذيلية، 0.9 ملم الوحشي، و 2.5 مم ظهراني بطني، مع يتعلق bregma). ولكن إذا البنى العميقة هي الهدف من هذا البحث، ثم سوف تكون هناك حاجة إلى الفواصل. وبالمثل، إذا هو المطلوب نقطة التسليم الخارجية المزيد (أي.، القشرة)، ثم المزيد من أقراص هل سيكون ضروريا. يجب أن تكون القسطرة طويلة بما فيه الكفاية بحيث مضخة ليست قريبة جدا من الرأس، لأنها سوف تعيق تحركات مذكرة التفاهمحد ذاتها، ولكن أيضا ليست طويلة جدا ومرة واحدة زرعها الطول المفرط قد يسبب القسطرة لثني، مما يزيد من خطر إزالة قنية من قبل الحركة الطبيعية من الفأرة. مقطع من 2 سم من القسطرة يعطي نتائج جيدة جدا من حيث التنقل والاستقرار للزرع (الشكلان 1 و 2). حضانة المضخة عند 37 درجة CO / N يسمح للمضخة لبدء ضخ المخدرات في الدماغ في لحظة زرع على الفور.
في زرع مضخة miniosmotic فمن الأهمية بمكان أن نؤكد أن الجمجمة تجفف بشكل صحيح قبل زرع قنية. عادة تنظيف مع 70٪ من الإيثانول من شأنها أن تحفز العظام لتجف، ولكن إذا وجدت النزيف المستمر، ولمس الجمجمة بلطف مع cauterizer سوف تجف تماما. ومن الأهمية بمكان أن نؤكد أن إدخال الإبرة كما العمودي وبطء ممكن. مرة واحدة في الموقف، وعلى الرغم من الغراء هو تجفيف، ووضع الإصبع على رأس قنية يمنعها من التحرك جانبيا اوفإيه الجمجمة. وينبغي إيلاء عناية خاصة على الجرح ووضع قنية. من المهم أن شق لا يتم تنفيذ بالضبط على خط الوسط من الجمجمة ولكن قليلا إلى الجانب الأيمن. عند إغلاق الجرح، إذا تم إجراء شق في خط الوسط، والجلد سوف يكون فوق طاقتها، مما يزيد من خطر فتح الجروح. وجعل شق قليلا إلى جانب واحد يسمح النقاط خياطة ليكون بعيدا عن أعلى جزء من قنية. ونتيجة لذلك سيكون هناك أقل من التوتر في نقاط خياطة وسوف الجرح تلتئم بشكل صحيح. وينبغي قفص الحيوانات وحده، وفحص كل يوم، وخصوصا خلال 10-15 يوما الأولى بعد الزرع. في حالة تفزر الجرح، الجروح يجب أن تكون مغلقة في أقرب وقت ممكن. إذا قنية إزالة أو تقدم الحيوان عدوى، لابد من انتهاء التجربة. لا ينصح بإعادة غرس قنية. من المهم جدا لزرع ناجحة لاستخدام كميات كافية من إعلان النسيجhesive (ليس كثيرا!) لأنه يحط من العظام ويزيد من خطر إزالة قنية. ومع ذلك باستخدام لاصق صغير جدا أيضا لن يعقد قنية تعلق على العظام. يمكن للمضخات miniosmotic تحمل الأدوية الذائبة في مجموعة واسعة من المواد، ويجري القيد الوحيد لهذا أن المذيب حيويا. بالإضافة إلى ذلك، بالنظر إلى أن حجم صغير يجب (200 ميكرولتر) واحد تحديد ما إذا كان التركيز المطلوب للتجربة هو مناسب ولن يسبب هطول الأمطار داخل المضخة.
الجهاز تتبع إما تقدمي أو رجعي استشفاف هو أسلوب جدا راسخة لدراسة الربط الدماغ واللدونة. يجب أن تعطى الرعاية للإطارات استخدام المجسم عند حقن لضمان الدقة في استهداف منطقة الدماغ يرغب المرء في دراسة (أي، لمنع حقن في الجسم الثفني عند حقن القشرة).
لجميع التدخلات الجراحية وسعيا للحد من الألم والتهاب، ينبغي أن يعامل الحيوانات مع 0.1 ملغم / كغم البوبرينورفين قبل التدخل وCaprofen في 4 ملغم / كغم مرة واحدة في اليوم لمدة ثلاثة أيام بعد تدخل.
وفي الختام، فإن هذا النهج يوفر أداة مناسبة لدراسة تأثير البروتينات أو المركبات الدوائية في الدماغ المصاب، وهو ما يمثل الطريقة التي هي مناسبة تماما لإجراء دراسات عن ليونة الدماغ.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |