In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
長年にわたり、虚血性脳卒中または外傷性脳損傷などの神経変性疾患の研究は、急性脳卒中期におけるニューロンの生存を促進することを目的と神経保護療法の開発に注力してきました。診療所に変換する際のげっ歯類モデルにおいて有効であることが見出されている薬物療法の大部分は失敗しました。この治療の失敗の理由としては、機能的な神経学的回復を持続する、その結果持続薬物効果の欠如に限定されるものではありません。それは長い目で脳のリモデリングを促進戦略を開発することが重要です。失敗した神経保護試験の多数によって示唆されるように、単独でニューロンの生存の促進は、成功した脳卒中の回復を可能にするのに十分ではないため、神経可塑性の刺激は最近、フィールド内の主要な関心を得ています。
薬物送達のための手段は、腹腔内注射、尾の血管内のIでありますnjection、大腿注射、単一定位脳へのベクターの注入とミニ浸透圧ポンプにより一定の送達を継続します。我々は、脳への送達のために示したようにポンプは、カニューレを持っていない、または器官指向とすることができる場合には、後者は、全身送達を含めることができます。ミニ浸透圧ポンプの例外およびウイルスベクターを使用すると、他のすべての戦略が変動する薬物濃度を誘導します。長期の実験のために、それは、このように頻繁な注射を受けたストレスに動物を提出することが必要となります。 BBBは、脳内の治療濃度を達成するために巨大なタンパク質または薬剤の投与量を必要とし、その結果、血液からのタンパク質または薬物の脳への取り込みのための重要な障害を課します。例えばペジェグリーニ監督ら(2013年)5 30グラム(300グラムのラット750 IU /日)の動物を75 IU /日に線量当量で腹腔内注射によってのrhEPOを配信。 rhEpの比較では、標的送達脳へのoを0.25マイクロリットル/時間の一定の割合に大きな時間スケールにわたって回復を達成することができました、私たちは成功した脳卒中の回復のために私たちの研究では10 IU /日のはるかに低い用量を使用することができました。
本研究では、このようにBBBを回避する、心室に直接可塑性促進タンパク質のrhEPOをお届けするために、頭蓋骨に接続カニューレとミニポンプを移植する方法を示しています。この方法によって、のrhEPOは、梗塞サイズの縮小、グリア瘢痕形成の減少及び血管形成の誘導を含む、いくつかの方法で神経学的回復を促進しました。 rhEPOはまた、ニューロンの生存を促進し、除神経赤核と顔面神経核に向かってcontralesional運動野からの投射を増加させました。繊維の発芽は運動皮質( 図4Aおよび図5A)に順行管トレーサーBDAを注射することによって明らかにしました。繊維の発芽への機能的相関はPRです運動技能の向上( 図5B)によってovided。さらに、我々は、管トレーサー注入のための同様のアプローチは、逆行管トレーサーFG( 図6B)の注入により視床皮質接続を明らかにするために適用することができることを示しています。
ミニ浸透圧ポンプの製造では、ターゲットポイントとスペーサの使用を考慮することが重要です。私たちはで、針の非常に先端が与えられた座標(-0.2ミリメートルの尾、横0.9ミリメートル、2.5ミリメートル背腹で心室に接触している。この方法のように0.5ミリメートルによって、針の長さを短くするために、1つのスペーサーを使用ブレグマに対して)。深い構造は、研究の対象とされている場合は、その後、何のスペーサが必要とされません。同様に、もし複数の外部配信ポイント(すなわち、皮質)、次に以上のスペーサーディスクが必要となることが望まれます。ポンプヘッドに近づきすぎないように、それはMOUの動きを妨げますようカテーテルは、十分な長さでなければなりませんSEだけでなく、長すぎるように一度注入し、過剰な長さは、このように、マウスの自然な動きによって、カニューレの除去の危険性を増加させ、カテーテルが曲がることがありません。カテーテルの2センチ部は、インプラント( 図1および2)の移動性及び安定性の点で非常に良好な結果を与えます。 37°のCO / Nにおけるポンプのインキュベーションは、ポンプが直ちに注入の瞬間に脳内に薬剤をポンピング開始することができます。
ミニ浸透圧ポンプの移植では、頭蓋骨が適切にカニューレを移植する前に乾燥されることを保証することが重要です。通常、乾燥する骨を誘導する70%エタノールで洗浄するが、連続的な出血が見つかった場合、焼灼器で穏やかに頭蓋骨をタッチすると、完全に乾燥します。これは、針の導入が可能な限り垂直と遅いことを保証することが重要です。一度位置で、かつ接着剤が乾燥している間、カニューレの上に指を置くと、OV横に移動するのを防ぎますえー頭蓋骨。特別なケアは、カニューレの傷や配置に与えられるべきです。それは、切開が正確に頭蓋骨の中央ライン上ではなくやや右側に行われていないことが重要です。創傷を閉鎖すると切開が中間線で行われた場合、皮膚は、このように創傷開口のリスクを増加させ、過延伸になります。片側にわずかに切開を作ることは、縫合ポイントはカニューレの最も高い部分から離れてできるようになります。結果として、そこに縫合点にはあまりの緊張になり、傷が適切に治癒します。動物だけではケージに入れ、特に移植後の最初の10〜15日の間、毎日チェックする必要があります。巻か裂開の場合は、傷ができるだけ早く閉じする必要があります。カニューレが除去されるか、動物が感染を示した場合、実験を終了しなければなりません。カニューレの再注入は推奨されません。移植の成功は、組織の広告の適切な量を使用することは非常に重要ですhesive(あまりない!)、それが骨を劣化させ、カニューレの除去のリスクを増大させるように。しかし、あまりにも少ない接着剤を用いても、骨に取り付けられたカニューレを保持しています。ミニ浸透圧ポンプは、溶媒は、生体適合性であるこれにのみ制限され、多種多様な物質に溶解薬を運ぶことができます。さらに、ボリュームが小さいことを考えると(200μL)1は、実験に必要な濃度が適しているかどうかを判断しなければならないし、ポンプ内部の降水量が発生することはありません。
順行または逆行性トレーサーのいずれかを使用したトレースの道は、脳の接続性と可塑性を研究するために非常によく確立された技術です。一つは勉強したい脳の領域をターゲットに正確さを保証するために注入する場合には注意が使用定位フレームに与えられなければならない(皮質を注入する際、すなわち 、脳梁に注射を防ぐため)。
すべての外科的介入のための痛みを軽減するために、と炎症は、動物は介入後3日間一日一回に4mg / kgの介入とCaprofen前には0.1mg / kgのブプレノルフィンで治療すべきです。
結論として、このアプローチは、脳の可塑性の研究のために適している方法を示す、損傷した脳内のタンパク質または薬理学的化合物の効果を研究するための適切なツールを提供します。
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |