In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
Pendant de nombreuses années, la recherche sur les maladies neurodégénératives comme accident vasculaire cérébral ischémique ou une lésion cérébrale traumatique a mis l'accent sur le développement de thérapies neuroprotectrices qui visent à favoriser la survie neuronale dans la phase de l'AVC aigu. La grande majorité des thérapies médicamenteuses qui ont été trouvés pour être efficace dans des modèles rongeurs échoué quand il est traduit à la clinique. Les raisons de cet échec thérapeutique comprennent, mais ne sont pas limités à l'absence d'effets de drogues entraînant la persistance prolongée récupération neurologique fonctionnelle. Il est donc important de développer des stratégies de promotion cerveau remodelage à plus long terme. Parce que la promotion de la survie neuronale est seul ne suffit pas pour permettre la récupération de course réussie, comme suggéré par le grand nombre d'essais infructueux de neuroprotection, la stimulation de la plasticité neuronale a récemment obtenu un intérêt majeur dans le domaine.
Moyens pour la livraison de la drogue sont de injection intrapéritonéale, la queue i intravasculairenjection, injection fémorale, seule injection stéréotaxique de vecteurs dans le cerveau et la prestation continue constante par des pompes miniosmotiques. Ce dernier peut inclure l'administration systémique, si la pompe n'a pas une canule, ou qui peut être orgue dirigé, comme nous l'avons montré pour la livraison dans le cerveau. A l'exception des pompes miniosmotiques et l'utilisation de vecteurs viraux, toutes les autres stratégies vont induire des concentrations de médicament fluctuantes. Pour les expériences à long terme, il devient donc nécessaire de soumettre l'animal à la contrainte de recevoir des injections fréquentes. Le Bureau impose un obstacle important pour l'absorption de cerveau de protéines ou de médicaments à partir du sang, ce qui entraîne la nécessité de médicaments protéiques ou des doses considérables en vue d'atteindre des concentrations thérapeutiques dans le cerveau. Par exemple Pellegrini et al. (2013) 5 rhEpo délivrée par injection intraperitoneale à une dose équivalente à 75 UI / jour pour un animal de 30 g (750 UI / jour pour un rat de 300 g). En comparaison, la fourniture de RHEP cibléeo pour le cerveau nous a permis d'utiliser une dose beaucoup plus faible de seulement 10 UI / jour dans notre étude pour la reprise de la course réussie, qui nous a permis de parvenir à la reprise sur une grande échelle de temps à un taux fixe de 0,25 pi / h.
Dans ce travail, nous avons montré la méthode d'implantation de mini-pompes avec une canule reliée au crâne afin de délivrer la protéine de plasticité promotion rhEpo directement dans le ventricule, contournant ainsi le Bureau. Par ce procédé, la récupération neurologique rhEpo promu en un certain nombre de façons, y compris la réduction de la taille de l'infarctus, à la réduction de la formation de cicatrice gliale et de l'induction de l'angiogenèse. rhEpo également favorisé la survie neuronale accrue et des projections du cortex moteur contralésionnel vers le noyau rouge dénervé et les noyaux faciaux. La germination des fibres a été révélée par injection du traceur antérograde des voies BDA dans le cortex moteur (figures 4A et 5A). Une corrélation fonctionnelle à la germination des fibres est provided par l'amélioration de la motricité (figure 5B). En outre, nous avons montré que la même approche pour l'injection de traceur de l'appareil peut être appliqué à dévoiler les connexions thalamo-corticales par injection du traceur rétrograde des voies FG (Figure 6B).
Dans la préparation de la pompe miniosmotique, il est essentiel de considérer le point de cible et l'utilisation d'entretoises. Nous utilisons une entretoise de réduire la longueur de l'aiguille de 0,5 mm par que de cette manière la pointe de l'aiguille est en contact avec le ventricule aux coordonnées données (-0,2 mm caudale, 0,9 mm latéral, 2,5 mm dorso ventrale, avec rapport au bregma). Toutefois, si des structures plus profondes sont la cible de la recherche, alors aucun entretoises seront nécessaires. De même, si un point de livraison plus externe est souhaitée (ie., Le cortex), puis plusieurs disques d'écartement sera nécessaire. Le cathéter doit être suffisamment long pour que la pompe ne soit pas trop près de la tête, car il va gêner les mouvements du moucomme tel, mais également la durée excessive pas trop long, car une fois implanté peut provoquer le cathéter de se plier, ce qui augmente le risque de retrait de la canule par le mouvement naturel de la souris. Une section de 2 cm de cathéter donne de très bons résultats en termes de mobilité et de la stabilité de l'implant (figures 1 et 2). L'incubation de la pompe à 37 ° CO / N permet à la pompe de démarrer immédiatement pompage du médicament dans le cerveau au moment de l'implantation.
Dans la pompe miniosmotique implantation, il est essentiel d'assurer que le crâne est correctement séché avant l'implantation de la canule. Habituellement, le nettoyage avec 70% d'éthanol va induire l'os à sécher, mais si le saignement continue est trouvé, touchant le crâne doucement avec un cauterizer complètement sécher. Il est essentiel d'assurer que la mise en place de l'aiguille est aussi verticale que possible et lent. Une fois en position, et pendant que la colle est sèche, placer le doigt sur le dessus de la canule l'empêche de se déplacer latéralement over le crâne. Une attention particulière devrait être accordée à la blessure et le placement de la canule. Il est important que l'incision est effectuée exactement au-dessus pas la ligne médiane du crâne mais légèrement vers le côté droit. Lors de la fermeture de la plaie, si l'incision a été faite à la ligne médiane, la peau sera débordé, augmentant ainsi le risque de l'ouverture de la plaie. Faire légèrement l'incision d'un côté va permettre aux points de suture à être loin de la plus haute partie de la canule. En conséquence, il y aura moins de tension sur les points de suture et la plaie se cicatriser correctement. Les animaux doivent être mis en cage seul et vérifié chaque jour, surtout pendant les 10-15 premiers jours après l'implantation. En cas de déhiscence de la plaie, les plaies doivent être fermés dès que possible. Si la canule est retirée ou l'animal présente une infection, l'expérience doit être terminé. Re-implantation de la canule est déconseillée. Il est très important pour l'implantation réussie d'utiliser des quantités suffisantes de l'annonce de tissusadhésif (pas trop!) car il se dégrade l'os et augmente le risque de retrait de la canule. Cependant, l'utilisation trop peu de colle ne sera également pas tenir la canule fixée à l'os. Les pompes peuvent transporter miniosmotiques médicaments dissous dans une grande variété de substances, la seule limitation étant à ce que le solvant est biocompatible. En outre, étant donné que le volume est petit (200 ul) doit déterminer si une concentration requise pour l'essai est adapté à la et ne cause pas de précipitation à l'intérieur de la pompe.
Tract traçage soit antérograde ou rétrograde traceurs est une technique très bien établi pour étudier la connectivité du cerveau et de la plasticité. Soins doit être donnée à l'utilisation des cadres de stéréotaxie lors de l'injection pour assurer l'exactitude sur le ciblage de la zone du cerveau on veut étudier (par exemple, pour éviter l'injection sur le corps calleux lors de l'injection du cortex).
Pour toutes les interventions chirurgicales et afin de réduire la douleur etl'inflammation, les animaux doivent être traités avec 0,1 mg / kg buprénorphine avant l'intervention et Caprofen à 4 mg / kg une fois par jour pendant trois jours après l'intervention.
En conclusion, cette approche fournit un outil approprié pour étudier l'effet des protéines ou des composés pharmacologiques dans le cerveau lésé, ce qui représente une méthode qui est bien adapté pour les études sur la plasticité du cerveau.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |