In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
Per molti anni, la ricerca sulle malattie neurodegenerative come l'ictus ischemico o traumi cerebrali si è concentrata sullo sviluppo di terapie neuroprotettive che mirano a promuovere la sopravvivenza neuronale nella fase ictus acuto. La stragrande maggioranza delle terapie farmacologiche che sono stati trovati per essere efficace in modelli di roditori falliti quando tradotto in clinica. Ragioni di questo fallimento terapeutico comprendono ma non si limitano alla mancanza di effetti prolungati della droga con conseguente persistere recupero neurologico funzionale. E 'quindi importante sviluppare strategie di promozione rimodellamento del cervello nel lungo periodo. Poiché la promozione di sopravvivenza neuronale da sola non è sufficiente per consentire tempi di recupero di successo, come suggerito dal gran numero di prove neuroprotezione infruttuosi, la stimolazione di plasticità neuronale ha recentemente ottenuto grande interesse nel campo.
Mezzi per la consegna della droga sono l'iniezione intraperitoneale, coda i intravascolarenjection, iniezione femorale, iniezione stereotassica singolo di vettori nel cervello e ha continuato la consegna costante da pompe miniosmotic. Quest'ultimo può includere rilascio sistemico, se la pompa non ha una cannula, o che possono essere organo diretto, come abbiamo dimostrato per la consegna nel cervello. Con l'eccezione delle pompe miniosmotic e l'uso di vettori virali, tutte le altre strategie indurranno concentrazioni del farmaco fluttuanti. Per gli esperimenti a lungo termine diventa così necessario sottoporre l'animale allo stress di ricevere iniezioni frequenti. Il BBB impone un ostacolo importante per l'assorbimento del cervello di proteine o farmaci dal sangue, con la conseguente necessità di enormi proteine o droga dosaggi per raggiungere concentrazioni terapeutiche nel cervello. Per esempio Pellegrini et al. (2013) 5 consegnato rhEPO mediante iniezione intraperitoneale ad una dose equivalente a 75 UI / die per un animale di 30 g (750 IU / giorno per un 300 g ratto). In confronto, la consegna di RHEP miratao al cervello ci ha permesso di usare una dose molto più bassa di soli 10 UI / die nel nostro studio per tempi di recupero di successo, che ci ha permesso di ottenere il recupero su larga scala volta ad un tasso fisso di 0,25 ml / h.
In questo lavoro abbiamo dimostrato il metodo di impianto di minipompe con una cannula collegata al cranio, al fine di consegnare la plasticità promuovere proteina rhEPO direttamente nel ventricolo, eludendo così il BBB. Con questo metodo, rhEPO promosso recupero neurologico in un certo numero di modi, compresa la riduzione delle dimensioni dell'infarto, riduzione della formazione di cicatrici gliali e induzione di angiogenesi. rhEPO inoltre promosso la sopravvivenza neuronale ed ha aumentato le proiezioni dalla corteccia motoria controlesionale verso il nucleo rosso denervata e nuclei facciali. La germinazione delle fibre è stata rivelata mediante iniezione del tracciante anterogrado BDA tratto nella corteccia motoria (Figure 4A e 5A). Una correlazione funzionale alla germinazione delle fibre è provided dal miglioramento delle capacità motorie (Figura 5B). Inoltre, abbiamo dimostrato che lo stesso approccio per iniezione tratto tracciante può essere applicato per svelare talamo-corticale connessioni per iniezione del tracciante retrogrado tratto FG (Figura 6B).
Nella preparazione della pompa miniosmotic, è fondamentale considerare il punto di destinazione e l'impiego di distanziali. Usiamo un distanziale per ridurre la lunghezza dell'ago 0,5 millimetri come in questo modo sulla punta dell'ago è in contatto con il ventricolo nelle coordinate indicate (-0,2 mm caudale, 0,9 mm laterale 2.5 mm dorso ventrale, con rispetto al bregma). Tuttavia, se le strutture più profonde sono il bersaglio della ricerca, quindi non saranno necessari distanziatori. Analogamente, se un punto più esterno di mandata è desiderato (es., La corteccia), quindi più dischi distanziatori sarà necessario. Il catetere deve essere sufficientemente lungo in modo che la pompa non è troppo vicino alla testa, poiché impedirà movimenti del mouse, ma anche non troppo lungo quanto una volta impiantato lunghezza eccessiva può provocare il catetere per piegare, aumentando così il rischio di rimozione cannula dal movimento naturale del mouse. Una sezione di 2 cm di catetere dà ottimi risultati in termini di mobilità e stabilità dell'impianto (figure 1 e 2). L'incubazione della pompa a 37 ° CO / N consente alla pompa di avviare immediatamente pompare il farmaco nel cervello al momento dell'impianto.
Nella pompa impiantazione miniosmotic è fondamentale per assicurare che il cranio è asciugato correttamente prima di impiantare la cannula. Di solito la pulizia con il 70% di etanolo indurrà l'osso ad asciugare, ma se non si trova il sanguinamento continuo, sfiorando il cranio con un cauterizer sarà completamente asciugare. È fondamentale assicurare che l'introduzione dell'ago è verticale e lentamente possibile. Una volta in posizione, e mentre la colla sta asciugando, posizionando il dito sulla parte superiore della cannula impedisce di muoversi lateralmente over il cranio. Particolare attenzione deve essere data alla ferita e il posizionamento della cannula. È importante che l'incisione non viene eseguita esattamente sopra la linea mediana del cranio ma leggermente sul lato destro. Quando si chiude la ferita, se l'incisione è stata fatta alla linea mediana, la pelle sarà overstretched, aumentando così il rischio di apertura della ferita. Rendere leggermente l'incisione su un lato permetterà i punti di sutura di essere lontano dalla parte più alta della cannula. Di conseguenza ci sarà meno tensione sui punti di sutura e la ferita guarire correttamente. Gli animali devono essere in gabbia da solo e controllati ogni giorno, soprattutto durante i primi 10-15 giorni dopo l'impianto. In caso di deiscenza della ferita, ferite devono essere chiusi al più presto. Se la cannula viene rimossa o l'animale presenta un'infezione, l'esperimento deve essere terminato. Reimpianto della cannula non è raccomandato. E 'molto importante per impianto di successo utilizzare adeguate quantità di tessuto annunciocolla per (non troppo!) come degrada l'osso e aumenta il rischio di rimozione cannula. Tuttavia usando troppo poco adesivo anche non tenere la cannula attaccata all'osso. Le pompe possono trasportare farmaci miniosmotic disciolti in un ampia varietà di sostanze, essendo l'unica limitazione a questo che il solvente è biocompatibile. Inoltre, dato che il volume è piccolo (200 ml) si deve determinare se la concentrazione richiesta per l'esperimento è adatto e non provocare precipitazione all'interno della pompa.
Tract tracciando sia con anterograda o retrograde traccianti è una tecnica molto ben definito per studiare connettività cerebrale e la plasticità. La cura deve essere data ai fotogrammi uso stereotactic l'iniezione per assicurare l'accuratezza sul targeting l'area del cervello che si vuole studiare (ad esempio, per evitare che l'iniezione sul corpo calloso quando si inietta la corteccia).
Per tutti gli interventi chirurgici e per ridurre il dolore einfiammazione, gli animali devono essere trattati con 0,1 mg / kg Buprenorfina prima dell'intervento e Caprofen a 4 mg / kg una volta al giorno per tre giorni dopo l'intervento.
In conclusione, questo approccio fornisce uno strumento adeguato per lo studio dell'effetto delle proteine o composti farmacologici nel cervello danneggiato, che rappresenta un metodo che è adatto per gli studi sulla plasticità cerebrale.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |