In order to study brain reorganization under pathological conditions we used miniosmotic pumps for direct protein delivery into the brain circumventing the blood brain barrier. Tract tracers are then injected to study alterations in brain connectivity under the influence of the protein.
Pharmacological treatment in animal models of cerebral disease imposes the problem of repeated injection protocols that may induce stress in animals and result in impermanent tissue levels of the drug. Additionally, drug delivery to the brain is delicate due to the blood brain barrier (BBB), thus significantly reducing intracerebral concentrations of selective drugs after systemic administration. Therefore, a system that allows both constant drug delivery without peak levels and circumvention of the BBB is in order to achieve sufficiently high intracerebral concentrations of drugs that are impermeable to the BBB. In this context, miniosmotic pumps represent an ideal system for constant drug delivery at a fixed known rate that eludes the problem of daily injection stress in animals and that may also be used for direct brain delivery of drugs. Here, we describe a method for miniosmotic pump implantation and post operatory care that should be given to animals in order to successfully apply this technique. We embed the aforementioned experimental paradigm in standard procedures that are used for studying neuroplasticity within the brain of C57BL6 mice. Thus, we exposed animals to 30 min brain infarct and implanted with miniosmotic pumps connected to the skull via a cannula in order to deliver a pro-plasticity drug. Behavioral testing was done during 30 days of treatment. After removal the animals received injections of anterograde tract tracers to analyze neuronal plasticity in the chronic phase of recovery. Results indicated that neuroprotection by the delivered drug was accompanied with increase in motor fibers crossing the midline of the brain at target structures. The results affirm the value of these techniques for drug administration and brain plasticity studies in modern neuroscience.
The delivery of proteins and pharmacological compounds into the brain are important strategies for studying mechanisms underlying brain diseases and evaluating candidate molecules for new treatments 1,2. In experimental neurosciences, the delivery of vectors such as plasmids or adenoviruses has become an important tool for studying long-term actions of proteins in the brain 3,4. Single injections of vectors present the advantage of a system which by itself will maintain highly stable levels of the therapeutic agent in the brain 4. However, for long term experiments with purified drugs systemic administration by intraperitoneal injection induces stress in mice or rats, and is not the best choice when a targeted brain response is needed, requiring also large doses of drug5. Miniosmotic pumps represent an ideal system for prolonged direct drug delivery into the brain by circumventing both low accessibility to the brain and also peaks of drug concentration, as the delivery of the drug happens directly into a targeted place in the brain and at a fixed flow rate determined by the pump model that is chosen2,6,7. Indeed, this system has allowed us to successfully study brain recovery after stroke by delivery of several drugs such as recombinant human erythropoietin (rhEpo) and vascular endothelial growth factor 6,7.
Brain plasticity is essential for the rewiring of connections in response to brain injuries. Plasticity is a broad concept that ranges from the formation or elimination of synaptic contacts, growth of dendritic spines and also elongation or retraction of long distance connections8,9. The brain was previously believed to not be capable of reconstructing connections after a lesion. However many approaches have shown that if properly stimulated it can reestablish connectivity 6,7,10. One technique that is particularly useful to study this is the use of tract tracers. Anterograde tract tracers are compounds that can enter neurons at the soma and then distribute all along the axons until these reach their target structures. Two examples are cascade blue (CB) and biotinylated dextran amine (BDA). Conversely, retrograde tract tracers, such as cholera toxin B (CTB) or fluorogold (FG) enter the neuron through the axon terminal and then distribute back to the soma thus revealing the site of origin of neurons targeting the injection site.
Here, we present the methods that we use for implantation of miniosmotic pumps for direct delivery of proteins or drugs that have potential effects on neural plasticity as well as the injection of BDA and FG to unveil input and output connections to the motor cortex. BDA will also be used as an example of a tract tracer used to demonstrate increased plasticity of axons emerging from the co after stroke under rhEpo treatment.
Seit vielen Jahren hat die Forschung zu neurodegenerativen Erkrankungen wie Schlaganfall oder Schädel-Hirn-Verletzungen auf die Entwicklung von neuroprotektiven Therapien, die das Überleben von Neuronen in der akuten Schlaganfallphase zu fördern Ziel konzentriert. Die große Mehrheit der Drogen-Therapien, die gefunden wurden, um wirksam in Nagetiermodellen gescheitert, wenn in die Klinik übersetzten. Gründe für diese Therapieversagen umfassen, sind jedoch nicht auf das Ausbleiben einer nachhaltigen Arzneimittelwirkungen, was zu persistierende funktionelle neurologische Erholung beschränkt. Es ist daher wichtig, Strategien zu fördern Gehirn Umbau auf längere Sicht zu entwickeln. Denn die Förderung der neuronalen Überlebens allein nicht ausreicht, um erfolgreich Schlaganfall Erholung zu ermöglichen, wie durch die große Anzahl von erfolglosen Neuroprotektion Studien vorgeschlagen, die Stimulation der neuronalen Plastizität sich jüngst großes Interesse auf dem Gebiet.
Bedeutet für die Arzneimittelabgabe sind intraperitoneale Injektion, Schwanz intravaskuläre injection, Oberschenkel Injektion einzigen stereotaktische Injektion der Vektoren in das Gehirn und weiterhin konstante Lieferung von miniosmotische Pumpen. Letzteres kann eine systemische Verabreichung umfassen, wenn die Pumpe nicht über eine Kanüle oder die Orgel gerichtet werden können, wie wir für die Lieferung in das Gehirn gezeigt. Mit Ausnahme miniosmotische Pumpen und die Verwendung von viralen Vektoren, werden alle anderen Strategien schwankArzneimittelKonzentrationen induzieren. Für Langzeitexperimente somit wird es notwendig, um das Tier zum Druck des Empfangs häufige Injektionen vor. Die BBB erlegt erhebliches Hindernis für die Aufnahme in das Gehirn von Proteinen oder Medikamenten aus dem Blut, was zu der Notwendigkeit von großen Protein oder Medikamentendosierungen, um therapeutische Konzentrationen im Gehirn zu erreichen. Beispiels Pellegrini et al. (2013) geliefert rhEpo durch intraperitoneale Injektion in einer Dosis entsprechend 75 IU / Tag für ein Tier von 30 g (750 IU / Tag für einen 300 g Ratte) 5. Zum Vergleich: Die gezielte Abgabe von RHEPo an das Gehirn es uns ermöglicht, eine viel geringere Dosis von 10 IE / Tag in unserer Studie für eine erfolgreiche Wiederherstellung nach Schlaganfall, die es uns ermöglicht, Rückgewinnung über einen großen Zeitskala zu einem festen Zinssatz von 0,25 & mgr; l / h zu erzielen.
In dieser Arbeit haben wir das Verfahren der Implantation von Minipumpen mit einer Kanüle an dem Schädel, um die Plastizität fördernde Protein rhEpo direkt in den Ventrikel zu liefern, so dass unter Umgehung der BBB verbunden ist. Durch dieses Verfahren gefördert rhEpo neurologische Erholung in einer Anzahl von Wegen, einschließlich der Verringerung der Infarktgröße, Verringerung des glialen Narbenbildung und die Induktion von Angiogenese. rhEpo gefördert neuronale Überleben und erhöhte Projektionen aus dem kontraläsionalen motorischen Kortex in Richtung der denervierten roten Kern und Gesichts Kernen. Der Austrieb der Fasern wurde durch Injektion der anterograde Trakt Tracer BDA in den motorischen Cortex (4A und 5A), offenbart. Eine funktionelle Entsprechung zu dem Sprießen der Fasern prdurch die Verbesserung der motorischen Fähigkeiten (5B) ovided. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass der gleiche Ansatz für Trakt Tracerinjektion angewendet werden, um thalamo-kortikalen Verbindungen durch Injektion des retrograden Tracers FG-Darm-Trakt (6B) zu enthüllen werden.
Bei der Herstellung des miniosmotische Pumpe ist es wichtig, den Zielpunkt und die Verwendung von Abstandhaltern zu betrachten. Wir verwenden ein Abstandhalter, um die Länge der Nadel um 0,5 mm, wie auf diese Weise die Spitze der Nadel in Kontakt mit der Herzkammer auf den angegebenen Koordinaten (-0,2 mm caudal zu reduzieren, 0,9 mm lateral 2,5 mm dorso ventral mit bezüglich Bregma). Jedoch, wenn tiefere Strukturen sind das Ziel der Forschung, dann werden keine Abstandshalter erforderlich. Ebenso, wenn eine externe Abgabestelle gewünscht (dh., Dem Kortex), dann mehrere Distanzscheiben erforderlich. Der Katheter muss lang genug sein, damit die Pumpe nicht zu nah an den Kopf, als sie Bewegungen des mou behindernse, aber auch nicht zu lange im implantierten Überlänge kann bewirken, dass der Katheter zu biegen, so dass die Gefahr der Kanüle Entfernung durch die natürliche Bewegung der Maus. Ein Abschnitt von 2 cm des Katheters liefert sehr gute Ergebnisse hinsichtlich der Beweglichkeit und Stabilität des Implantats (1 und 2). Inkubation der Pumpe bei 37 ° CO / N kann die Pumpe sofort zu starten Pumpen des Arzneimittels in das Gehirn im Augenblick der Implantation.
Im miniosmotische Pumpenimplantation ist es entscheidend, sicherzustellen, daß der Schädel ist, bevor die Implantation der Kanüle getrocknet. Normalerweise Reinigung mit 70% Ethanol wird der Knochen, um zu trocknen zu induzieren, aber wenn kontinuierliche Blutungen gefunden wird, berührt den Schädel vorsichtig mit einem Ausbrenner vollständig trocknen. Es ist kritisch, um sicherzustellen, dass die Einführung der Nadel als vertikale und langsam wie möglich. Einmal in Position, und während der Klebstoff trocknet, indem die Finger auf der Oberseite der Kanüle verhindert, dass sie sich seitwärts bewegt over den Schädel. Besondere Sorgfalt sollte auf die Wunde und die Platzierung der Kanüle gegeben. Wichtig ist, daß der Schnitt nicht genau über der Mittellinie des Schädels, aber leicht zur rechten Seite durchgeführt. Beim Schließen der Wunde, wenn der Einschnitt an der Mittellinie gemacht, die Haut wird überdehnt werden, wodurch das Risiko von Wundöffnung zunimmt. Dem Schnitt leicht zu einer Seite ermöglicht die Nahtstellen, um weg von dem höchsten Teil der Kanüle ist. Als Folge wird es weniger Spannung auf die Nahtstellen und die Wunde wird richtig zu heilen. Die Tiere sollten nur in Käfigen gehalten werden und überprüft jeden Tag, besonders während der ersten 10-15 Tage nach der Implantation. Im Falle Wunddehiszenz haben Wunden so schnell wie möglich geschlossen werden. Wenn die Kanüle entfernt wird, oder das Tier stellt eine Infektion wurde das Experiment beendet. Reimplantation der Kanüle wird nicht empfohlen. Es ist sehr wichtig für eine erfolgreiche Implantation ausreichende Mengen an Gewebe ad verwendenKLEBEND (nicht zu viel!), wie es verschlechtert die Knochen und erhöht das Risiko der Kanüle entfernen. Jedoch mit zu wenig Klebstoff wird auch die Kanüle bis auf die Knochen befestigt nicht halten. Die miniosmotische Pumpen können in einer breiten Vielfalt von Stoffen gelöste Arzneimittel tragen, wobei die einzige Einschränkung dieser daß das Lösungsmittel biokompatibel. Zusätzlich, da das Volumen klein ist (200 ul) bestimmt werden, ob die für das Experiment benötigte Konzentration ist geeignet und wird nicht Ausfällung innerhalb der Pumpe führen.
Tract Verfolgung entweder mit anterograden oder retrograde Tracer ist eine sehr gut etablierte Technik zum Gehirn-Konnektivität und Plastizität zu untersuchen. Sorgfalt muss für die Verwendung der stereotaktischen Rahmen bei der Injektion, um die Genauigkeit über die Ausrichtung der Gehirnbereich zu studieren wünscht, einen Nutzen zieht (das heißt zur Injektion auf dem Balken zu verhindern, wenn das Einspritzen des Cortex).
Für alle chirurgischen Eingriffe und um Schmerzen zu reduzieren undEntzündungen, sollten die Tiere mit 0,1 mg / kg Buprenorphin 4 mg / kg einmal täglich für drei Tage nach der Operation behandelt werden vor dem Eingriff und Caprofen.
Abschließend bietet dieser Ansatz eine richtige Werkzeug für die Untersuchung Wirkung von Proteinen oder pharmakologische Verbindungen im verletzten Gehirn, die eine Methode, die gut für Studien über die Plastizität des Gehirns geeignet ist.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Dr. Werner Jackstädt Foundation (to Eduardo Sanchez-Mendoza), the German Academic Exchange Service (DAAD; to Jeismar Carballo), the German Research Council (HE3173/2-1, HE3173/2-2, and HE3173/3-1; to Dirk M. Hermann), Heinz Nixdorf Foundation (to Dirk M. Hermann).
Alzet miniosmotic pump. Model 2004. | Alzet | 000298 | Drug container |
Brain infusion kit 3 1-3mm | Alzet | 0008851 | Drug brain delivery system |
Loctite 454 Prism gel | Loctite | 45404 | Cyanoacrylate adhesive for cannula adhesion to the skull |
75N glass syringe | Hamilton | 87900/00 | Injection of tract tracers |
Biotin Dextran Amine (10000 MW) | Molecular probes | N-7167 | Anterograde tract tracer |
Fluorogold | Fluorochrome, LLC. | Retrograde tract tracer | |
Quintessential Stereotaxic Injector (QSI) | Stoelting | 53311 | Stereotactic device for coordinate determination, pump implantation and tract tracer injection. |