Complejos HLA / péptido intactos clase I se derraman por las células cancerosas, lo que representa un potencial biomarcador del cáncer relevante. Utilizando la tecnología de sensor de etiqueta libre y receptor de células T imitando anticuerpos monoclonales, detección de cobertizo MIF / HLA-A * 02: 01 complejos en los sobrenadantes de células MDA-MB-231, Punta de suero humano, y el plasma del paciente se demuestra, lo que permite el desarrollo de una novela cáncer de la plataforma de diagnóstico.
Según la Sociedad Americana del Cáncer, más de 200.000 mujeres serán diagnosticadas con cáncer de mama invasivo cada año y aproximadamente 40.000 morirán de la enfermedad. Muestras de la clase de antígenos leucocitarios humanos (HLA) I péptidos derivados de la degradación proteasomal de las proteínas celulares y presenta estos fragmentos en la superficie celular para ser interrogado por los que circulan los linfocitos T citotóxicos (CTL). Generación de imitar receptor de células T (TCRM) anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen el cáncer de mama específica de péptido / HLA-A * 02: 01 complejos tales como los derivados de factor inhibidor de la migración de macrófagos (MIF 19-27) y NY-ESO- 1 157-165 permiten la detección y destrucción de las células del cáncer de mama en la ausencia de una respuesta eficaz CTL antitumoral. Complejos HLA / péptido intactos clase I se derraman por las células de cáncer de mama y representan biomarcadores de cáncer potencialmente relevantes. En este trabajo, un sistema de detección de biomarcadores gran avance para el cáncer de diagnósticos incorporación de receptor de células T anticuerpos monoclonales imitan combinados con una novela, biosensor libre de etiquetas utilizando-modo guiado de resonancia tecnología de sensores (GMR) se presenta. Detección de cobertizo MIF / HLA-A * 02: 01 complejos en los sobrenadantes de células MDA-MB-231, Punta de suero humano, y el plasma del paciente se demuestra. El impacto de este trabajo podría revolucionar la medicina personalizada a través del desarrollo de diagnóstico de enfermedades de compañía para inmunoterapias específicas.
El antígeno leucocitario humano de clase I (HLA) muestras de péptidos de 8-11 aminoácidos de longitud derivados de la degradación proteasomal del repertorio de proteínas intracelulares y presenta estos péptidos en la superficie de todas las células nucleadas 1,2. El complejo HLA es "biomarcador de la naturaleza", lo que indica la salud de cada célula (Figura 1) para que circulan los linfocitos T citotóxicos (CTL). Reconocimiento de la enfermedad asociada péptidos resultados en la eliminación de la célula infractor por CTL. Por lo tanto, la respuesta inmune adaptativa es muy efectivo en la eliminación de la infección viral y tumor. Sin embargo, el sistema inmune ejerce una presión que a menudo promueve la selección en busca de virus o tumor capaz de evadir una respuesta eficaz de CTL. Receptores de células T (imitando TCRM) anticuerpos monoclonales (mAb) que reconocen específica de péptido / HLA-A * 02: 01 complejos tales como los derivados de proteínas asociadas con cáncer de mama, factor de migración de macrófagos inhibitoria (MIF19-27) 3 y NY-ESO-1 157-165, permiten la detección y destrucción de las células del cáncer de mama en la ausencia de un antitumoral efectiva de respuestas de CTL 4,5. Este trabajo representativo se centra en el HLA-A * 0201 molécula, que se expresa hasta en un 30% de la población. Sin embargo, la identificación de otros complejos de HLA / péptido relevantes, seguido por la producción de TCRM permite el desarrollo de inmunoterapias dirigidas y el diagnóstico de enfermedades compañera, la ampliación de la utilidad de este trabajo a una población mucho más amplia.
Una porción de los complejos de péptido / HLA con destino a la superficie celular se libera en el plasma. Debido a la naturaleza altamente compleja de péptidos / HLA piscinas, los métodos actuales para la minería de la immunopeptidome de biomarcadores HLA asociados son mucho tiempo. Este proceso requiere la purificación por afinidad de HLA soluble a partir de plasma, la separación de HLA péptidos asociados por cromatografía líquida de alta presión de fase inversa(RP-HPLC) y la secuenciación de péptidos por espectrometría de masas en tándem (MS / MS) 6,7. Aunque este proceso es una opción viable para el descubrimiento de nuevas dianas terapéuticas, es un proceso engorroso como una herramienta de diagnóstico compañero para objetivos asociados HLA ya en la vacuna terapéutica o de la tubería biofarmacéutica 8-10. TCRM dirigida contra estos objetivos proporcionan las herramientas para el desarrollo de diagnóstico compañero rápida destinadas a estratificar a los pacientes en los ensayos clínicos pertinentes y ofrecer opciones terapéuticas más informadas.
En este trabajo, un sistema de detección de biomarcadores gran avance para el diagnóstico del cáncer se presenta que utiliza TCRM y un sistema de bioensayo libre de etiquetas que monitorea las interacciones biológicas con pasos de procesamiento mínimos. El sistema de bioensayo-etiqueta libre se basa en un método, que utiliza el efecto de resonancia de modo de guiado (GMR) que se produce en rejillas de guía de onda dieléctrica 11-14. Cuando los contactos de luz de banda ancha de la difracciónrejilla en las placas requeridas para este sistema, dos longitudes de onda específicas se reflejan. La interacción de unión entre un receptor y su ligando inmovilizado se monitoriza en tiempo real mediante el seguimiento del cambio de longitud de onda de resonancia con un analizador de espectro 12. Picos de resonancia separadas se producen por el incidente TE (normal al plano de incidencia vector eléctrico) y TM (vector magnético normal al plano de incidencia) estados de polarización que proporcionan múltiples puntos de datos que puede aumentar potencialmente la precisión de detección 11,14. El uso de anticuerpos placas pre-sensibilizadas en este sistema de ensayo libre de etiquetas, el tiempo de ejecución de un ensayo con el análisis de datos es de aproximadamente 45 min. Además, múltiples muestras de pacientes pueden ser interrogados en un formato de 96 o 384 pocillos, una clara ventaja sobre un formato basado en HPLC-MS / MS.
El método descrito en este documento introduce un sistema de detección de biomarcadores para el diagnóstico del cáncer que permitan la detección rápida de complejos de péptido / HLA solubles en suero, plasma, orina o saliva muestras de pacientes en un alto rendimiento de 96 o de formato de 384 pocillos. Este sistema de ensayo que utiliza receptor de la célula T imitando anticuerpos monoclonales y un sistema de detección de etiqueta libre reduce el tiempo de análisis a menos de 1 hr en comparación con 3,5 hr por ELISA convencional. Este enfoque de alto rendimiento permite una rápida estratificación de los pacientes a los ensayos clínicos de vacunas terapéuticas de cáncer o productos biofarmacéuticos. Los métodos actuales para la detección de estos objetivos enfermedad requieren purificación por afinidad y HPLC-MS / MS de muestras de pacientes individuales, un proceso que consume tiempo y engorroso. Aunque este método es susceptible de técnicas de ELISA convencionales, existe la preocupación de que los reactivos de detección secundarias, tales como el anticuerpo anti-microglobulina β2 podrían alterar la estructura de la naciente HLUna molécula de inhibir la unión y a la detección limitar TCRM. Detección sin etiquetas alivia estas preocupaciones. Este procedimiento podría ser modificado para su uso en otros sistemas de etiqueta libre tal como un sistema de resonancia de plasmón superficial. Sin embargo, esto reduciría en gran medida las capacidades de rendimiento más altos en comparación con el sistema de bioensayo utilizado en este estudio.
Este protocolo puede ser modificado de manera efectiva para la detección de biomarcadores no HLA en el suero y plasma del paciente con la adherencia a unos pocos pasos críticos. Se recomienda el control del proceso de recubrimiento inicial de anticuerpos para la optimización de la superficie, como <200 pm cambio dará lugar probablemente a baja señal para la etapa posterior detección. La línea de base y post-lavado lee son útiles para el análisis de seguridad como la abundancia de proteínas de suero puede enmascarar la unión de baja concentración de analito. Finalmente, la variación de temperatura de las muestras puede dar como resultado así a la variación también. Se recomienda que todas las muestras se pre-incubaron und el controlador de temperatura de la unidad biosassay libre etiqueta fijado en 3.2 ° C por encima de la temperatura ambiente. Las muestras refrigeradas deben disponer de tiempo suficiente para alcanzar la temperatura de funcionamiento.
Las modificaciones futuras de este protocolo incluirán multiplexación de TCRM en la superficie de la placa. El sistema de bioensayo es actualmente susceptibles de manchas de pozos a una densidad de al menos 8-plex. Mediante la introducción de 4-8 TCRM a cada pocillo, por volúmenes de muestra de prueba se reducen y permitir la recogida de datos cada vez más complejos por paciente. Esta capacidad podría informar además los pacientes con respecto a las opciones terapéuticas.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |