מתחמי HLA / פפטיד אני כיתה שלמים הם מזילים על ידי תאים סרטניים, המייצגים את סמן ביולוגי לסרטן רלוונטי פוטנציאלי. ניצול טכנולוגיה ללא תווית חיישן וקולט T-cell מחקה נוגדנים חד-שבטיים, זיהוי של הסככה MIF / HLA-A * 02: 01 מתחמים בsupernatants תא מד"א MB-231, זינקו בסרום אנושי, ופלזמה חולה הפגינה, המאפשרת פיתוח של סרטן רומן פלטפורמת אבחון.
על פי האגודה האמריקנית לסרטן, יותר מ -200,000 נשים יאובחנו עם סרטן שד פולשני בכל שנה וכ -40,000 ימותו מהמחלה. כיתת אנטיגן לויקוציטים האנושי (HLA) אני דגימות פפטידים הנגזרים משפלת proteasomal של חלבונים תאיים ומציג קטעים אלה על פני התא לחקירה על ידי לימפוציטים במחזור T ציטוטוקסי (CTL). דור של לחקות קולט T-cell (TCRm) נוגדנים חד-שבטיים (מבז) שיכיר בסרטן השד פפטיד / HLA-ספציפי * 02: 01 מתחמים כגון אלה נגזרים מגורם הגירת מקרופאג מעכב (MIF 19-27) וNY-ESO- 1 157-165 מאפשר זיהוי והרס של תאי סרטן השד בהעדר תגובת CTL אנטי גידול יעיל. מתחמי HLA / פפטיד אני כיתה שלמים הם מזילים על ידי תאי סרטן שד ומייצגים סמנים לסרטן שעשוי להיות רלוונטיים. בעבודה זו, מערכת הקרנת סמן ביולוגי פריצת דרך לטיפול בסרטן אבחוןs שילוב קולטן תא T נוגדנים חד-שבטיים לחקות בשילוב עם רומן, biosensor ללא תווית ניצול טכנולוגיית חיישן תהודה מודרכת במצב (GMR) מוצג. איתור של הסככה MIF / HLA-A * 02: 01 מתחמים בsupernatants תא מד"א MB-231, זינקו בסרום אנושי, והפלזמה חולה הפגינה. ההשפעה על עבודה זו יכולה לחולל מהפכה ברפואה מותאמת אישית באמצעות פיתוח של אבחון מחלה נלווה עבור חיסוניים ממוקד.
דגימות הכיתה אנטיגן אני יקוציט האדם (HLA) פפטידים של 8-11 חומצות אמינו באורך נובעות משפלת proteasomal של רפרטואר החלבון תאיים ומציג פפטידים אלה על פני השטח של כל תא גרעיני 1,2. המורכב HLA הוא "הסמן הביולוגי של הטבע", המציין את בריאותו של כל תא (איור 1) לימפוציטים מסוג T במחזור ציטוטוקסיות (CTL). הכרה בתוצאות פפטידים מחלה קשורה בחיסול של התא הפוגע בCTL. לפיכך, התגובה החיסונית אדפטיבית היא יעילה מאוד במניעת זיהום וגידול ויראלי. עם זאת, המערכת החיסונית מפעילה לחץ אשר לעתים קרובות מקדם בחירה לאיתור וירוסים או גידול מסוגל להתחמק תגובת CTL יעילה. קולט T-cell מחקה (TCRm) נוגדנים חד-שבטיים (מבז) אשר מזהה פפטיד / HLA-ספציפיים * 02: 01 מתחמים כגון אלה נגזרים מחלבונים הקשורים לסרטן השד, גורם מעכב הגירת מקרופאג (MIF19-27) 3 וNY-ESO 157-165-1, לאפשר זיהוי והרס של תאי סרטן השד בהעדר אנטי גידול יעיל CTL תגובת 4,5. עבודת נציג זה מתמקדת בHLA-A * 0201 המולקולה, אשר באה לידי ביטוי בשיעור של עד 30% מהאוכלוסייה. עם זאת, זיהוי של קומפלקסי HLA / פפטיד רלוונטיים אחרים, ואחריו את הייצור של TCRm מאפשר הפיתוח חיסוני ממוקדים ואבחון מחלה נלווית, הרחבת השירות של עבודה זו לאוכלוסייה רחבה בהרבה.
חלק ממתחמי פפטיד / HLA מחויבים לתא השטח משתחרר לפלזמה. בשל האופי המורכב ביותר של פפטיד / בריכות HLA, שיטות קיימים לכרייה immunopeptidome לסמנים ביולוגיים HLA נלווים נמצאים זמן רב. תהליך זה דורש טיהור הזיקה של HLA המסיס מפלזמה, הפרדה של פפטידים הקשורים HLA על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה שלב הפוך(RP-HPLC) ורצף הפפטיד על ידי ספקטרומטריית טנדם מסה (MS / MS) 6,7. למרות שתהליך זה הוא אפשרות מעשית לגילוי מטרות טיפוליות חדשניות, זה תהליך מסורבל ככלי אבחון לוויה למטרות הקשורות HLA כבר בחיסון הטיפולי או הצינור ביולוגי 8-10. TCRm מכוון נגד מטרות אלה מספקות כלים לפיתוח אבחון לוויה מהיר שנועדו stratifying חולים לניסויים קליניים רלוונטיים ולספק אפשרויות טיפוליות מושכלות יותר.
בעבודה זו, מערכת הקרנת סמן ביולוגי פריצת דרך לאבחון הסרטן מוצגת אשר מנצלת TCRm ומערכת המבדק ללא תווית העוקבת אחר אינטראקציות ביולוגיות בצעדי עיבוד מינימאליים. מערכת המבדק ללא תווית מבוססת על שיטה, אשר מנצלת את אפקט תהודה המודרך במצב (GMR) שמתרחש בתיל מוליך גל דיאלקטרי 11-14. כאשר אנשי קשר בפס רחב אור דיפרקטיביתצורם בלוחות דרושים למערכת זו, שני אורכי גל מסוימים באים לידי הביטוי. האינטראקציה מחייבת בין קולט משותק ויגנד הוא פיקוח בזמן אמת על ידי מעקב משמרת גל התהודה עם מנתח ספקטרום 12. פסגות תהודה נפרדות להתרחש אירוע TE (וקטור חשמלי רגיל למטוס של שכיחות) וTM (וקטור מגנטי רגיל למטוס של שכיחות) מצבי קיטוב מתן נקודות נתונים מרובים שעלול להגדיל את דיוק זיהוי 11,14. שימוש בצלחות מראש רגישות-נוגדן במערכת assay ללא תווית זו, זמן ריצת assay עם ניתוח הנתונים הוא כ -45 דקות. בנוסף, ניתן נחקרו דגימות חולים מרובות בפורמט 96 או 384 גם, יתרון ברור על פני פורמט המבוסס HPLC-MS / MS.
השיטה המתוארת במסמך זה מציגה מערכת הקרנת סמן ביולוגי לאבחון הסרטן שיאפשר איתור מהיר של מתחמי פפטיד / HLA מסיסים בדגימות סרום, פלזמה, שתן או רוק מטופל בתפוקה גבוהה 96 או בפורמט 384 גם. מערכת assay זה ניצול קולט תא T מחקה נוגדנים חד-שבטיים ומערכת זיהוי ללא תווית חותכת את זמן ניתוח לשעה פחות מ 1 לעומת 3.5 שעות על ידי ELISA הקונבנציונלי. גישת תפוקה גבוהה זו מאפשרת ריבוד מהיר של חולים לניסויים קליניים לחיסוני סרטן טיפוליים או תרופות ביולוגיות. שיטות קיימים לגילוי מטרות מחלה אלה דורשים טיהור זיקה וHPLC-MS / MS של דגימות מטופל, תהליך שגוזל זמן ומסורבל. למרות ששיטה זו היא נוחה לטכניקות ELISA קונבנציונליות, קיים חשש כי ריאגנטים זיהוי משניים כגון נוגדני microglobulin אנטי-β2 יכולים לשנות את המבנה של HL המתהווהמולקולה ומעכבות מחייבת זיהוי הגבלת TCRm. זיהוי ללא תווית מקל חששות אלה. הליך זה יכול להיות שונה לשימוש במערכות ללא תווית אחרות כגון מערכת תהודת plasmon פני השטח. עם זאת, זה יפחית באופן משמעותי את יכולות התפוקה גבוהות יותר בהשוואה למערכת המבדק שימשה במחקר זה.
פרוטוקול זה יכול להיות שונה באופן יעיל לגילוי של סמנים ביולוגיים שאינו HLA בסרום ופלזמה חולה עם דבקות בכמה שלבים קריטיים. ניטור של תהליך ציפוי נוגדן הראשוני מומלץ לאופטימיזציה של פני השטח, כמו <משמרת 200 בערב צפוי לגרום לאות נמוכה לצעד זיהוי שלאחר מכן. קוראים תחילת המחקר ולאחר שטיפה-שימושיים לניתוח נקודת הסיום כשפע של חלבונים בסרום עלול להסוות מחייב של אנליטי ריכוז נמוך. לבסוף, שינויי הטמפרטורה של דגימות יכולות לגרום גם וריאציה גם ל. מומלץ כי כל הדגימות מראש מודגרותד בקר טמפרטורת יחידת biosassay ללא תווית להיות מוגדר ב2-3 מעלות צלזיוס מעל לטמפרטורת חדר. יש לאפשר דגימות בקירור מספיק זמן כדי להגיע לטמפרטורת ההפעלה.
שינויים עתידיים של פרוטוקול זה יכללו ריבוב של TCRm על פני השטח הצלחת. מערכת המבדק היא כיום מקובל תצפית של בארות בצפיפות של לפחות 8-Plex. על ידי החדרת 4-8 TCRm היטב כל אחד, בכל כרכי מדגם בדיקה מופחתים ומאפשר איסוף נתונים מורכבים יותר ויותר למטופל. יכולת זו יכולה עוד ליידע את החולים לגבי אפשרויות טיפוליות.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |