Intatte classe I complessi HLA / peptide sono capannone dalle cellule tumorali, che rappresenta un potenziale biomarcatore cancro rilevante. Utilizzando la tecnologia dei sensori senza etichetta e il recettore delle cellule T mimando anticorpi monoclonali, rilevamento di capannone MIF / HLA-A * 02: 01 complessi in sovranatanti cellulari MDA-MB-231, spillo siero umano, e plasma del paziente è dimostrata, consentendo lo sviluppo di un romanzo cancro piattaforma diagnostica.
Secondo l'American Cancer Society, più di 200.000 donne saranno con diagnosi di cancro al seno invasivo ogni anno e circa 40.000 moriranno dalla malattia. Campioni La classe antigene leucocitario umano (HLA) I peptidi derivati dal proteasoma degradazione delle proteine cellulari e presenta questi frammenti sulla superficie cellulare per essere interrogati dai linfociti circolanti T citotossici (CTL). Generazione di mimica recettore delle cellule T (TCRM) anticorpi monoclonali (MAK, MAB), che riconoscono il cancro al seno specifico peptide / HLA-A * 02: 01 complessi, come quelli derivati dalla migrazione dei macrofagi fattore inibitorio (MIF 19-27) e NY-ESO- 1 157-165 consentire l'individuazione e la distruzione delle cellule del cancro al seno, in assenza di una efficace risposta CTL anti-tumorale. Intatte classe I complessi HLA / peptide sono capannone dalle cellule di cancro al seno e rappresentano potenzialmente rilevanti biomarcatori tumorali. In questo lavoro, un sistema di screening per il cancro svolta biomarcatore diagnosticos incorporando recettore delle cellule T anticorpi monoclonali mimici combinati con un romanzo, biosensore senza etichetta che utilizza in modalità guidata di risonanza (GMR) tecnologia dei sensori è presentato. Rilevamento di capannone MIF / HLA-A * 02: 01 complessi in sovranatanti cellulari MDA-MB-231, a spillo siero umano e plasma del paziente è dimostrata. L'impatto di questo lavoro potrebbe rivoluzionare la medicina personalizzata attraverso lo sviluppo della diagnostica delle malattie compagno per immunoterapie mirate.
Gli antigeni di classe I (HLA) campioni peptidi di 8-11 aminoacidi di lunghezza derivanti dalla degradazione proteasoma della proteina intracellulare repertorio e presenta questi peptidi sulla superficie di ogni cellula nucleata 1,2. Il complesso HLA è "biomarker della natura", indicante la salute di ogni cella (Figura 1) per circolanti linfociti T citotossici (CTL). Il riconoscimento di malattia associata peptidi provoca l'eliminazione della cellula incriminata dal CTL. Pertanto, la risposta immunitaria adattativa è altamente efficace per eliminare l'infezione virale e tumore. Tuttavia, il sistema immunitario esercita una pressione che spesso promuove selezione di virus o tumore grado di eludere una risposta efficace CTL. Recettore delle cellule T (mimando TCRM) anticorpi monoclonali (MAK, MAB), che riconoscono specifici peptide / HLA-A * 02: 01 complessi, come quelli derivati da proteine associate al cancro al seno, fattore inibitorio migrazione di macrofagi (MIF19-27) 3 e NY-ESO-1 157-165, consentire l'individuazione e la distruzione delle cellule del cancro al seno, in assenza di un anti-tumorale efficace CTL risposta 4,5. Questo lavoro rappresentativo è focalizzata sulla HLA-A * 0201 molecola, che si esprime fino al 30% della popolazione. Tuttavia, l'identificazione delle altre pertinenti complessi HLA / peptide, seguita dalla produzione di TCRM consente lo sviluppo di immunoterapie mirate e diagnostica delle malattie guidata, espandendo l'utilità di questo lavoro ad una popolazione molto più ampio.
Una parte dei complessi peptide / HLA dirette superficie cellulare viene rilasciata nel plasma. A causa della elevata complessità del peptide / piscine HLA, gli attuali metodi per l'estrazione del immunopeptidome per biomarcatori HLA associati sono tempo. Questo processo richiede la purificazione per affinità di HLA solubili dal plasma, separazione dei peptidi HLA associati da fase inversa cromatografia liquida ad alta pressione(RP-HPLC) e peptide sequenziamento mediante spettrometria di massa tandem (MS / MS) 6,7. Anche se questo processo è una valida opzione per la scoperta di nuovi bersagli terapeutici, è un processo complicato come strumento diagnostico compagno per obiettivi connessi HLA già nel vaccino terapeutico o di una condotta biofarmaceutica 8-10. TCRM diretto contro questi obiettivi forniscono gli strumenti per un rapido sviluppo compagno diagnostica volte a stratificazione dei pazienti in studi clinici rilevanti e fornire opzioni terapeutiche più informate.
In questo lavoro, un sistema di screening svolta biomarker per la diagnosi del cancro è presentato che utilizza TCRM e un sistema di test biologico privo di etichetta che controlla le interazioni biologiche con minime fasi di lavorazione. Il sistema di saggio biologico senza etichetta si basa su un metodo, che utilizza l'effetto di risonanza modo guidato (GMR) che si verifica in reticoli guida dielettrica 11-14. Quando la luce a banda larga di diffrazionegrattugiatura nelle piastre necessari per questo sistema, due specifiche lunghezze d'onda vengono riflesse. L'interazione di legame tra un recettore immobilizzato e il suo ligando è monitorata in tempo reale tracciando spostamento della lunghezza d'onda di risonanza con un analizzatore di spettro 12. Picchi di risonanza separati verificano per incidente TE (vettore elettrico normale al piano di incidenza) e TM (magnetica vettore normale al piano di incidenza) stati di polarizzazione forniscono più punti di dati che possono potenzialmente aumentare la precisione di rilevamento 11,14. Utilizzando anticorpi lastre pre-sensibilizzate in questo sistema di analisi privo di etichetta, il tempo di esecuzione del test con l'analisi dei dati è di circa 45 min. Inoltre, più campioni del paziente possono essere interrogati in un formato da 96 o 384 pozzetti, un chiaro vantaggio rispetto un formato basato HPLC-MS / MS.
Il metodo descritto introduce un sistema di screening per la diagnosi del cancro biomarker che permettano la rapida individuazione di solubili complessi peptide / HLA in campioni di siero, plasma, urina o saliva di pazienti in un volume alto 96- o 384 pozzetti. Questo sistema di dosaggio utilizzando recettore delle cellule T imitando anticorpi monoclonali e un sistema di rilevamento senza etichetta taglia il tempo di analisi per meno di 1 ora rispetto a 3,5 hr mediante ELISA convenzionale. Questo approccio high-throughput consente una rapida stratificazione dei pazienti per gli studi clinici per i vaccini terapeutici del cancro o farmaci biologici. Gli attuali metodi per l'individuazione di questi obiettivi di malattia richiedono purificazione per affinità e HPLC-MS / MS dei campioni individuali, un processo che richiede tempo e ingombrante. Anche se questo metodo è suscettibile di tecniche convenzionali ELISA, vi è la preoccupazione che i reagenti di rivelazione secondari come l'anticorpo anti-microglobulina β2 potrebbero alterare la struttura del nascente HLUna molecola ed inibire il legame al rilevamento limitazione TCRM. Free Detection-Label allevia queste preoccupazioni. Questa procedura può essere modificata per l'uso su altri sistemi senza etichetta come un sistema di risonanza plasmonica di superficie. Tuttavia, ciò ridurrebbe notevolmente le capacità di throughput superiori rispetto al sistema di saggio biologico utilizzato in questo studio.
Questo protocollo può essere efficacemente modificato per l'individuazione di biomarker non-HLA nel siero del paziente e plasma con aderenza ad alcuni punti critici. Il monitoraggio del processo di rivestimento anticorpo iniziale è raccomandato per l'ottimizzazione della superficie, come <200 pm spostamento probabilmente porterà a segnale basso per la fase successiva rilevazione. La linea di base e post-wash legge sono utili per l'analisi finale, come l'abbondanza di proteine del siero può mascherare vincolante di bassa concentrazione dell'analita. Infine, variazione di temperatura dei campioni può provocare a variazioni ben bene. Si raccomanda che tutti i campioni siano pre-incubate und il biosassay libera termoregolatore unità etichetta fissato a 2-3 ° C sopra la temperatura ambiente. Campioni refrigerati dovrebbe essere consentito un tempo sufficiente per raggiungere la temperatura di esercizio.
Modifiche future di questo protocollo comprenderanno multiplexing del TCRM sulla superficie della piastra. Il sistema biologico è attualmente suscettibili di macchia di pozzetti ad una densità di almeno 8-plex. Con l'introduzione di 4-8 TCRM a ciascun pozzetto, per volumi di campione di prova sono ridotti e consentire la raccolta di dati sempre più complesse per paziente. Questa capacità potrebbe informare ulteriormente i pazienti per quanto riguarda le opzioni terapeutiche.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |