그대로 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 암 관련 잠재적 바이오 마커를 나타내는 암세포 흘린된다. 모노클로 날 항체, 쉐드 MIF / HLA-A의 검출을 흉내 라벨없는 센서 기술 및 T 세포 수용체를 활용 * 02 : MDA-MB-231 세포 상청액 01 착물은, 인간 혈청 아군 및 환자 혈장의 개발을 가능하게 입증된다 새로운 암 진단 플랫폼입니다.
미국 암 학회 (American Cancer Society)에 따르면, 20 만 명 이상의 여성들이 침습적 유방암 매년 진단되고 약 40,000 병으로 죽을 것이다. 인간 백혈구 항원 (HLA) 클래스 I의 세포 단백질 시료 프로 테오 분해로부터 유도 된 펩티드를 순환 및 세포 독성 T 림프구 (CTL)에 의해 심문 세포 표면에 이러한 단편을 제시한다. T 세포 수용체 모방의 발생 (TCRM) 모노클로 날 항체 유방암 인식 (모노클로 날 항체) 특정 펩타이드 / HLA-A * 02 : 대 식세포 이동 억제 인자 (MIF 19-27) 및 NY-ESO-로부터 유도 된 것과 같은 01 착체 1 157-165은 효과적인 항 종양 CTL 반응의 부재 하에서 검출 및 유방암 세포의 파괴를 가능하게한다. 본래 클래스 I HLA / 펩타이드 복합체는 유방암 세포에 의해 창고 및 잠재적으로 관련 암 바이오 마커를 표현하고 있습니다. 이 작품은, 진단 암에 대한 획기적인 바이오 마커 검사 시스템에서T 세포 수용체를 가이드 모드 공명 (GMR) 센서 기술을 이용하여 신규, 라벨없는 바이오 센서와 결합 모방 모노클로 날 항체를 포함하는 s를 제공한다. 창고 MIF / HLA-A의 검출은 * 02 : MDA-MB-231 세포 상층 액 01 단지는, 인간 혈청 아군, 환자 플라즈마가 설명된다. 이 작품의 영향을 대상으로 면역을위한 동반자 질환 진단의 개발을 통해 맞춤 의학 혁명을 가져다 줄 수있을 것이다.
클래스 I 인간 백혈구 항원 (HLA)의 시료 세포 내 단백질의 레퍼토리 프로 테오 분해로부터 유도 된 길이가 8-11 개의 아미노산의 펩티드는 모든 유핵 세포 1,2- 표면의 펩타이드를 제공한다. HLA 복합체 순환은 세포 독성 T 림프구 (CTL)를 (도 1) 각각의 셀의 상태를 나타내는 "자연의 바이오 마커"이다. CTL에 의해 일으키는 세포의 제거에 질병 관련 펩티드 결과의 인식. 따라서, 적응 면역 반응이 바이러스 감염 및 종양의 제거에 매우 효과적이다. 그러나 면역 체계는 종종 효과적인 CTL 응답을 회피 할 수있는 바이러스 나 종양에 대한 선택을 촉진 압력을가한다. 모방하는 T 세포 수용체 (TCRM) 모노클로 날 항체의 특정 펩티드 / HLA-A * 02 인식 (모노클로 날 항체) : 유방암 관련 단백질, 대 식세포 이동 억제 인자로부터 유도 된 것과 같은 01 착체 (MIF19-27) 3 및 NY-ESO-1은 157-165, CTL은 4,5- 대응 방법 효과적인 항 종양의 부재 하에서 검출 및 유방암 세포의 파괴를 가능하게한다. 이 작업은 대표적인 인구의 30 %까지 발현 HLA-A * 0201 분자에 집중된다. 그러나, TCRM의 생산 다음에 다른 관련 HLA / 펩타이드 복합체의 식별은 훨씬 광범위한 인구 작품의 유틸리티를 확대하고, 대상 면역 요법과 동반 질환 진단의 개발을 가능하게한다.
세포 표면에 대한 결합 펩티드 / HLA 복합체의 부분은 플라즈마 내로 방출된다. 때문에 HLA 관련 바이오 마커의 immunopeptidome 광산에 대한 펩타이드 / HLA 풀, 현재의 방법의 매우 복잡한 특성으로 인해 시간이 소요됩니다. 이 프로세스는 플라즈마로부터 가용성 HLA의 친 화성 정제를 필요로 역상 고압 액체 크로마토 연관된 HLA 펩티드의 분리탠덤 질량 분광법 (MS / MS) -6,7- 그래피 (RP-HPLC) 및 펩타이드 서열. 이 프로세스는 신규 한 치료 적 표적의 발견을위한 가능한 선택이지만, 이미 치료 백신 또는 바이오 파이프 라인 80-10에서 HLA 연관된 타겟 동반자 진단 도구로 성가신 과정이다. 이러한 목표는 관련 임상 시험에 환자를 계층화하고 더 많은 정보 치료 옵션을 제공하기위한 신속한 동반자 진단 개발을위한 도구를 제공에 대해 TCRM은 지시했다.
본 연구에서는 암 진단을위한 획기적인 바이오 마커 검사 시스템은 TCRM 최소한의 처리 단계와 생물학적 상호 작용을 모니터링하는 라벨이없는 생물 검정 시스템을 사용하는 표시됩니다. 라벨없는 생물 분석 시스템은 유전체 도파로 격자 11-14 발생 가이드 모드 공명 (GMR) 효과를 이용한 방법에 기초한다. 때 광대역 빛이 접촉 회절을이 시스템에 필요한 접시에 격자, 두 가지 특정 파장이 반영됩니다. 고정화 된 수용체와 리간드 간의 결합 상호 작용이 스펙트럼 분석기 (12)와 공명 파장 시프트를 추적하여 실시간으로 모니터링된다. 별도의 공진 피크는 입사 TE (입사면에 수직 전기 벡터) 및 TM (입사면에 수직 인 자기 벡터) 잠재적 11,14 검출 정밀도를 높일 수있는 다수의 데이터 포인트를 제공하는 편광 상태에 대해 발생한다. 이 라벨없는 측정계 항체 미리 감응 플레이트를 사용하여 데이터 분석을 분석 실행 시간은 약 45 분이다. 또한, 다수의 환자 샘플을 HPLC-MS / MS 기반 포맷 위에, 96- 또는 384- 웰 포맷 분명한 이점을 심문 할 수있다.
본원에 기재된 방법은 높은 처리량 환자의 혈청, 혈장, 소변 또는 타액 시료에 가용성 펩티드 / HLA 복합체의 신속한 검출을 가능 96- 또는 384- 웰 포맷 것이다 암 진단을위한 바이오 마커 스크리닝 시스템을 소개한다. 모노클로 날 항체 및 라벨없는 검출 시스템을 흉내 T 세포 수용체를 이용하여 상기 분석 시스템은 통상의 ELISA에 의해 3.5 시간에 비해 1 시간 미만으로 분석 시간을 삭감. 이 높은 처리량 방법은 치료 암 백신 또는 바이오 의약품에 대한 임상 시험에 환자의 신속한 계층화 할 수 있습니다. 이러한 질병 표적 검출을위한 현재의 방법은 개별 환자 샘플 번거롭고 시간 소모적 프로세스의 친 화성 정제 및 HPLC-MS / MS를 필요로한다. 이 방법은 종래의 ELISA 기법 의무가 있지만, 이러한 우려를 방지 β2 마이크로 글로불린 항체와 같은 보조 검출 시약은 초기 HL의 구조를 변경할 수있다분자는 TCRM 제한 검출에 결합 억제한다. 라벨없는 검출은 이러한 우려를 완화. 이 과정은 이러한 표면 플라즈몬 공명 시스템으로 다른 라벨없는 시스템에서 사용하기 위해 수정 될 수있다. 그러나이 크게 본 연구에서 사용 된 생물학적 검정 시스템에 비해 높은 처리 능력을 감소시킬 것이다.
이 프로토콜은 효과적으로 몇 가지 중요한 단계 준수와 환자의 혈청 및 혈장 비 HLA 바이오 마커의 검출을 위해 수정할 수 있습니다. <200 PM 시프트 가능성 후속 검출 단계 낮은 신호 발생하므로 초기 항체 코팅 공정의 모니터링은, 표면의 최적화를 위해 권장된다. 혈청 단백질의 풍부가 낮은 농도 분석의 결합 마스크 수 있으므로 기준 및 사후 세척 읽기는 엔드 포인트 분석하는 데 유용합니다. 마지막으로, 샘플의 온도 변화에 잘 잘 변화에 발생할 수 있습니다. 그것은 모든 샘플을 미리 배양하는 것이 좋습니다D 라벨없는 biosassay 부 온도 컨트롤러는 실온 이상에서 2-3 ℃로 설정 될 수있다. 냉장 샘플 작동 온도에 도달 할 수있는 충분한 시간을 허용한다.
이 프로토콜의 장래 변형이 플레이트 표면에 TCRM의 다중화를 포함한다. 생물 검정 시스템은 적어도 8 플렉스의 밀도로 우물의 안보에 현재 의무가 있습니다. 시험 샘플 볼륨 당, 각 웰에 4-8 TCRM을 도입함으로써 감소 및 환자 당 점점 복잡한 데이터의 수집을 가능하게한다. 이 기능은 더 치료 옵션과 관련하여 환자를 제공하는 계기가 될 것이다.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |