無傷のクラスI HLA /ペプチド複合体は、潜在的な関連癌バイオマーカーを表す、癌細胞により流されている。ラベルフリー検出技術を利用し、T細胞受容体はモノクローナル抗体を模倣し、小屋MIF / HLA-A * 02の検出:MDA-MB-231細胞の上清中の01複合体、ヒト血清にスパイクし、そして患者の血漿をの開発を可能にする、実証されている小説癌診断プラットフォーム。
米国癌協会によると、20万人以上の女性が毎年浸潤性乳癌と診断され、約4万は病気で死亡する。ヒト白血球抗原(HLA)クラスIサンプル細胞タンパク質のプロテアソーム分解に由来するペプチドを、循環細胞傷害性Tリンパ球(CTL)の問い合わせのための細胞表面上のこれらのフラグメントを提示する。 * 02乳癌特異的ペプチド/ HLA-Aを認識するT細胞受容体模倣体の発生(TCRM)モノクローナル抗体(mAb):01は、マクロファージ遊走阻止因子に由来するものなどの複合体(MIF 19-27)およびNY-ESO- 1 157-165は、有効な抗腫瘍CTL応答の非存在下で検出および乳癌細胞の破壊を可能にする。無傷のクラスI HLA /ペプチド複合体は、乳癌細胞により流され、潜在的に関連する癌バイオマーカーを表す。この作品、癌診断のための画期的なバイオマーカーのスクリーニングシステムではT細胞受容体の導波モード共鳴(GMR)センサ技術を用いた新規な、ラベルフリーバイオセンサーと組み合わせ模倣するモノクローナル抗体を組み込んだ。■が提示される。小屋MIF / HLA-A * 02の検出:MDA-MB-231細胞上清中の01複合体は、ヒト血清をスパイクし、そして患者の血漿を示されている。この作品の影響は、ターゲットと免疫療法のためのコンパニオン疾患の診断の開発を通じてオーダーメイド医療に革命をもたらす可能性があります。
長さが8〜11個のアミノ酸のクラスIヒト白血球抗原(HLA)のサンプルのペプチドは、細胞内タンパク質のレパートリーのプロテアソーム分解に由来し、あらゆる有核細胞1,2の表面にこれらのペプチドを提示する。 HLA複合体は、循環細胞傷害性Tリンパ球(CTL)へ( 図1)は、各セルの状態を示す「自然のバイオマーカー」である。 CTLによる問題の細胞の排除における疾患関連ペプチド結果の認識。したがって、適応免疫応答は、ウイルス感染および腫瘍を排除するのに非常に効果的である。しかしながら、免疫系はしばしば効果的なCTL応答を回避することができるウイルスまたは腫瘍の選択を促進する圧力を加える。乳癌関連タンパク質、マクロファージ遊走阻止因子に由来するもののような01の錯体(MIF:特定のペプチド/ HLA-A * 02を認識するT細胞受容体模倣(TCRM)モノクローナル抗体(mAb)19-27)3およびNY-ESO-1 157-165、有効な抗腫瘍CTL応答4,5の非存在下での乳癌細胞の検出および破壊を可能にする。この代表的な作業は、人口の30%までで表現されるHLA-A * 0201分子に焦点を当てている。しかし、TCRMの生産が続く他の関連するHLA /ペプチド複合体の同定は、はるかに広い人口にこの作品の有用性を拡大し、目標と免疫療法とコンパニオン疾患の診断の開発を可能にします。
細胞表面にバインドされたペプチド/ HLA複合体の一部がプラズマ中に放出される。によりペプチド/ HLAプールの非常に複雑な性質のため、HLA関連するバイオマーカーのためのimmunopeptidomeをマイニングのための現在の方法は時間がかかる。このプロセスは、血漿からの可溶性HLAのアフィニティー精製を必要とし、逆相高圧液体クロマトグラフィーによってHLA関連ペプチドの分離タンデム質量分析(MS / MS)6,7によって(RP-HPLC)、およびペプチド配列決定。このプロセスは、新たな治療標的の発見のために実行可能な選択肢ではあるが、それはすでに治療ワクチンやバイオ医薬品パイプライン8-10におけるHLA関連標的のためのコンパニオン診断ツールとして面倒なプロセスである。これらの目標に向けられたTCRMは、関連する臨床試験に患者を層別化を目的とした急速なコンパニオン診断開発のためのツールを提供し、より多くの情報に基づいた治療選択肢を提供する。
この作品では、癌の診断のための画期的なバイオマーカーのスクリーニングシステムは、TCRMと最小限の処理ステップとの生物学的相互作用を監視し、ラベルフリーバイオアッセイ系を利用した提示されている。無標識バイオアッセイ系は、誘電体導波路格子11-14に生じる導波モード共鳴(GMR)効果を利用した方法に基づいている。ときに広帯域光の連絡回折このシステムに必要なプレートで格子、2特定の波長が反映されます。固定された受容体とそのリガンドの間の結合相互作用は、スペクトラムアナライザ12の共振波長シフトを追跡することによって、リアルタイムでモニターされる。別個の共振ピークは、入射TE(入射面に垂直な電気ベクトル)およびTM(入射面に垂直な磁気ベクトル)潜在的に検出精度11,14を増加させることができる複数のデータポイントを提供する偏光状態のために起こる。このラベルフリーアッセイ系で抗体予め感作されたプレートを用いて、データ分析を用いたアッセイの実行時間は約45分である。さらに、複数の患者試料を、HPLC-MS / MSベースのフォーマット上で、96または384ウェルフォーマットで明らかな利点を調べることができる。
本明細書に記載の方法は、高スループットの96または384ウェルフォーマットで患者の血清、血漿、尿または唾液サンプル中の可溶性ペプチド/ HLA複合体の迅速な検出を可能にする癌診断用のバイオマーカーのスクリーニングシステムを導入する。モノクローナル抗体を模倣するT細胞受容体と標識不使用検出システムを利用し、このアッセイ系は、従来のELISAによって3.5時間と比較して、1時間未満に分析時間を切断する。このハイスループットアプローチは、治療用癌ワクチンやバイオ医薬品のための臨床試験への患者の迅速な層別化を可能にします。これらの疾患標的の検出のための現在の方法は、個々の患者の試料のアフィニティー精製およびHPLC-MS / MS、面倒で時間のかかるプロセスを必要とする。この方法は、従来のELISA技術に適しているが、このような抗β2ミクログロブリン抗体などの二次検出試薬は、発生期のHLの構造を変化させる可能性が懸念されている分子とTCRM制限検出への結合を阻害する。ラベルフリー検出は、これらの懸念を緩和する。この手順は、表面プラズモン共鳴システムなどの他の無標識システムでの使用のために改変することができる。しかし、これは非常に本研究で用いたバイオアッセイ系と比較して、より高いスループット能力を減少させるであろう。
このプロトコルは、事実上、いくつかの重要なステップの遵守と患者血清と血漿中の非HLAバイオマーカーの検出のために修飾することができる。 <200 PMシフトはおそらくその後の検出工程のために低信号になりますように最初の抗体コーティングプロセスのモニタリングは、表面の最適化のために推奨されます。血清タンパク質の存在量が低濃度の分析物の結合をマスクすることができるように、ベースラインと洗浄後の読み取りエンドポイント解析のために有用である。最後に、試料の温度変化は、ウェル変動で生じ得る。これは、すべてのサンプルがプレインキュベートすることをお勧めしますdはラベルフリーbiosassay部温度コントローラは、室温以上、2-3℃に設定すること。冷蔵試料は、動作温度に到達するのに十分な時間を許容されるべきである。
このプロトコルの将来の変更は、プレート表面上のTCRMの多重化を含む。バイオアッセイシステムは、少なくとも8プレックスの密度で、ウェルのスポッティングに現在適している。各ウェルに4-8 TCRMを導入することにより、試験試料体積当たり低減し、患者ごとにますます複雑なデータの収集を可能にしている。この機能は、さらなる治療選択肢に関して患者に知らせることができます。
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |