Des complexes HLA / peptide de classe I intactes sont éliminées par les cellules cancéreuses, ce qui représente un biomarqueur potentiel de cancer concerné. En utilisant la technologie des capteurs sans étiquette et récepteur des cellules T imitant les anticorps monoclonaux, la détection de la remise MIF / HLA-A * 02: 01 complexes dans les surnageants de cellules MDA-MB-231, dopés sérum humain, et le plasma du patient est démontrée, ce qui permet le développement de un nouveau cancer de la plateforme de diagnostic.
Selon l'American Cancer Society, plus de 200 000 femmes recevront un diagnostic de cancer du sein invasif chaque année et environ 40 000 mourront de la maladie. Échantillons I La classe antigène leucocytaire humain (HLA) de peptides dérivés de la dégradation par le protéasome des protéines cellulaires et présente ces fragments sur la surface de la cellule pour un interrogatoire par circulant lymphocytes T cytotoxiques (CTL). Génération d'synoptique du récepteur des cellules T (TCRM) des anticorps monoclonaux (mAbs) qui reconnaissent le cancer du sein spécifique peptide / HLA-A * 02: 01 complexes tels que ceux dérivés de MIF MIF (19-27) et NY-ESO- 1 157-165 permettre la détection et la destruction des cellules du cancer du sein en l'absence d'une réponse efficace de CTL anti-tumeur. Des complexes HLA / peptide de classe I intactes sont éliminées par les cellules cancéreuses du sein et du cancer représentent biomarqueurs potentiellement pertinents. Dans ce travail, un système de dépistage percée biomarqueur du cancer de diagnostics intégrant récepteur des cellules T anticorps monoclonaux imiter combinés avec un roman, biocapteur sans étiquette utilisant résonance mode guidé (GMR) la technologie des capteurs est présenté. Détection de remise MIF / HLA-A * 02: 01 complexes dans les surnageants de cellules MDA-MB-231, additionné de sérum humain, et le plasma du patient est mise en évidence. L'impact de ce travail pourrait révolutionner la médecine personnalisée à travers le développement du diagnostic de la maladie de compagnie pour les immunothérapies ciblées.
La classe antigène I leucocytes humains (HLA) échantillons peptides de 8-11 acides aminés provenant de la dégradation par le protéasome du répertoire de la protéine intracellulaire et présente ces peptides sur la surface de chaque cellule nucléée 1,2. Le complexe de HLA est le «biomarqueur de la nature", indiquant l'état de chaque cellule (figure 1) qui circulent à lymphocytes T cytotoxiques (CTL). La reconnaissance de maladie associé peptides résultats dans l'élimination de la cellule incriminée par CTL. Ainsi, la réponse immunitaire adaptative est très efficace pour éliminer l'infection virale et de la tumeur. Toutefois, le système immunitaire exerce une pression de sélection qui favorise souvent des virus ou une tumeur capables de soustraire une réponse CTL efficace. Récepteur des cellules T (mimant TCRM) des anticorps monoclonaux (mAbs) qui reconnaissent spécifique de peptide / HLA-A * 02: 01 complexes tels que ceux dérivés de protéines associées au cancer du sein, le facteur inhibiteur de migration des macrophages (MIF19-27) 3 et NY-ESO-1 157-165, permettre la détection et la destruction des cellules du cancer du sein en l'absence d'un anti-tumorale efficace réponse CTL 4,5. Ce produit représentatif est centrée sur le HLA-A * 0201, qui est exprimé par jusqu'à 30% de la population. Toutefois, l'identification d'autres complexes HLA / peptide pertinentes, suivie par la production de TCRM permet le développement d'immunothérapies ciblées et le diagnostic des maladies compagnon, l'expansion de l'utilité de ce travail à une population beaucoup plus large.
Une partie des complexes de peptide / HLA à destination de la surface de la cellule est libérée dans le plasma. En raison de la nature très complexe de peptide / HLA piscines, les méthodes actuelles de l'exploitation minière du immunopeptidome de biomarqueurs associés sont HLA temps. Ce procédé nécessite la purification par affinité de l'antigène HLA soluble du plasma, la séparation des peptides HLA associés par chromatographie liquide haute pression en phase inverse(RP-HPLC) et le séquençage de peptides par spectrométrie de masse en tandem (MS / MS) 6,7. Bien que ce processus est une option viable pour la découverte de nouvelles cibles thérapeutiques, ce est un processus lourd comme un outil de diagnostic compagnon pour les cibles associées HLA déjà dans le vaccin thérapeutique ou d'un pipeline biopharmaceutique 8-10. TCRM dirigée contre ces objectifs fournissent les outils pour le développement de diagnostic compagnon rapide visant à stratifier les patients dans les essais cliniques pertinents et fournir des options thérapeutiques plus éclairées.
Dans ce travail, un système de criblage percée de biomarqueur pour le diagnostic du cancer est présenté TCRM et qui utilise un système d'essai biologique sans étiquette qui surveille les interactions biologiques avec des étapes de traitement minimum. Le système d'essai biologique sans marquage est basé sur un procédé qui utilise l'effet de résonance à mode guidé (GMR) qui se produit dans des réseaux de guides d'ondes diélectriques 14/11. Lorsque les contacts de lumière à large bande de la diffractiongrille dans les plaques nécessaires pour ce système, deux longueurs d'onde spécifiques sont reflétés. L'interaction de liaison entre un récepteur et son ligand immobilisé est suivie en temps réel en surveillant le décalage de longueur d'onde de résonance avec un analyseur de spectre 12. Séparer les pics de résonance se produisent pour incidente TE (vecteur électrique perpendiculaire au plan d'incidence) et TM (magnétique vecteur normal au plan d'incidence) des états de polarisation fournissant de multiples points de données qui peuvent potentiellement augmenter la précision de détection 11,14. En utilisant des plaques pré-sensibilisées anticorps dans ce système d'essai sans étiquette, le temps d'exécution de test d'analyse de données est d'environ 45 min. En outre, plusieurs échantillons de patients peuvent être interrogés dans un format à 96 ou 384 puits, un net avantage sur un format basé sur HPLC-MS / MS.
Le procédé décrit ici introduit un système de dépistage des biomarqueurs pour le diagnostic de cancer qui permettraient la détection rapide des complexes peptide / HLA solubles dans des échantillons de sérum, plasma, l'urine ou la salive des patients dans un haut débit à 96 ou au format 384 puits. Ce système de dosage utilisant récepteur des cellules T imitant des anticorps monoclonaux et un système de détection sans marquage réduit le temps d'analyse à moins de 1 h par rapport à 3,5 h par ELISA classique. Cette approche à haut débit permet la stratification rapide des patients aux essais cliniques pour des vaccins thérapeutiques contre le cancer ou les produits biopharmaceutiques. Les méthodes actuelles pour la détection de ces cibles pathologiques exigent la purification d'affinité et HPLC-MS / MS des échantillons de patients individuels, un processus qui prend du lourd et du temps. Bien que cette méthode se prête à des techniques ELISA classiques, il est à craindre que les réactifs de détection secondaires tels que l'anticorps anti-β2 microglobuline pourraient modifier la structure de la HL naissanteUne molécule et inhiber la liaison à la détection limitant TCRM. Détection sans étiquette atténue ces préoccupations. Cette procédure pourrait être modifié pour être utilisé sur d'autres systèmes sans marquage tel qu'un système de résonance de plasmon de surface. Cependant, cela réduirait considérablement les capacités de débit élevées par rapport au système d'essai biologique utilisée dans cette étude.
Ce protocole peut être modifié de manière efficace pour la détection de biomarqueurs non-HLA dans le sérum du patient et du plasma avec le respect de quelques pas critiques. Le suivi du processus de revêtement d'anticorps initial est recommandé pour l'optimisation de la surface, en tant que <200 pm décalage entraînera probablement faible signal pour l'étape de détection ultérieure. La ligne de base et post-lavage lit sont utiles pour l'analyse de point de terminaison que l'abondance de protéines sériques peut masquer liaison de faible analyte de concentration. Enfin, la variation de température des échantillons peut se traduire par une variation bien également. Il est recommandé que tous les échantillons sont incubés une préd le contrôleur de température de l'unité de biosassay libre de l'étiquette est fixée à 2-3 ° C au-dessus de la température ambiante. Les échantillons réfrigérés doivent être autorisés suffisamment de temps pour atteindre la température de fonctionnement.
Modifications futures de ce protocole incluront le multiplexage de TCRM sur la surface de la plaque. Le système d'essai biologique est actuellement prête à repérer des puits à une densité d'au moins 8-plex. En introduisant 8.4 TCRM à chaque puits, pour des volumes d'échantillon de test sont réduites et permettre la collecte de données de plus en plus complexes par patient. Cette capacité pourrait encore informer les patients en ce qui concerne les options thérapeutiques.
The authors have nothing to disclose.
These studies were supported in part by the Development Corporation of Abilene which provides laboratory space and salary support for Experimmune, a Center for Immunotherapeutic Development at Texas Tech University Health Sciences Center and Resonant Sensors Incorporated.
Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description (optional) |
ResoSens Label-free Bioassay Detection System | Resonant Sensors Incorporated | ||
Avidin Sensitized Bionetic 96-well Plates | Resonant Sensors Incorporated | ||
ResoVu software | Resonant Sensors Incorporated | ||
RL21A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
RL9A Biotinylated TCRm mAb | PureMHC, LLC | ||
FLSL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: FLSELTQQL | |
SLLV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: SLLMWITQV | |
YLEV HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: YLEPGPVTV | |
KVL HLA-A*02:01 Monomer | Experimmune | full peptide sequence: KVLEYVIKV | |
Pooled Normal Human Serum | ThermoFisher | BP2657100 | |
MDA-MB-231 Cell Supernatant | ATCC | HTB-26 | Cells grown in IMDM , 10% FBS and 1% penn/strep. Supernatants harvested from 3 day confluent cultures. |
Iscove's Modification of Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-053 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Life Technologies | 10082-147 | |
Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15070-63 | |
Sodium Hydroxide | ThermoFisher | 5318-1 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | ThermoFisher | BP665-1 | |
Phosphate Buffered Saline + 0.05% Tween 20 (PBST) | ThermoFisher | BP337-500 | |
2,2’-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid]-diammonium salt (ABTS) | ThermoFisher | 37615 | |
rabbit anti-human β2 microglobulin | Dako | A0072 | |
Peroxidase conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immunoresearch | 111-035-144 | |
Nunc microplates | ThermoFisher | 439454 | |
Synergy 2 microplate reader | Biotek | ||
Immpress Reagent Kit | Vector | MP-7402 | |
Immpact DAB | Vector | SK-4105 | |
Hematoxylin QS | Vector | H3403 | |
IgG2a | MP BioMedicals | 50328 | |
IgG2b | MP BioMedicals | 50330 | |
anti-HLA-A2 (BB7.2) | Experimmune | ||
Prism 5 | Graphpad |