Fare Fetal Karaciğer Kültür Sistemi Terminali Eritropoiesis Erken ve Geç Dönemlerinde Hedef Gene İşlevleri teşrih etmek
Summary
Biz terminali eritropoezin erken ve geç aşamaları masaya bir in vitro fare fetal karaciğer erythroblast kültür sistemi sunuyoruz. Bu sistem, farklı gelişim aşamasındaki özel genlerin işlevsel analiz kolaylaştırır.
Abstract
Eritropoez hızla birimleri oluşturan eritroid koloni (CFU-Es) bölünmesiyle ardından taahhüt eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es) ile başlayan dinamik bir süreç gerektirir. CFU-Es sonra hücreler morfolojik olarak algılanabilen ve genelde bağlantı eritroblastlarda olarak adlandırılır. Terminal eritropoezin çalışma için zorluklardan biri kronolojik bir şekilde gen fonksiyonlarını incelemek için deneysel yaklaşımların olmaması. Bu protokol, biz terminali eritropoezin erken ve geç evrelerinde gen fonksiyonlarını belirlemek için benzersiz bir strateji belirlemelidir. Bu sistemde, bir fare fetal karaciğer Ter119 (olgun eritroid hücre işaretleme maddesi) negatif Eritroblastlar saflaştırılmış ve cDNA veya ilgi duyulan genler için küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile transduse. Hücreler, bundan sonra, eksojen cDNA veya shRNAs izin verirken 12 saat boyunca da projenitör sahne korumak Eritropoietin (EPO) dışındaki ortam ihtiva eden büyüme faktörleri kültürlendiifade etmek. Hücreler, egzojenez genetik malzeme, daha ifade edildi, hücre farklılaşmasını ve çoğalmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ortamına değiştirildi. Bu protokol, terminal eritropoezin erken evre gen fonksiyonlarının analizini kolaylaştırır. Geç aşama terminali eritrosit oluşumunu çalışmak için, hücreler hemen transdüksiyon sonra EPO ortamı içinde kültürlenmiştir. Transduse genetik malzeme olarak ifade edilmiştir, bu durumda, hücreler daha önce, terminal eritropoezi geç dönem için farklılaştırılmıştır. Biz terminali eritropoezin farklı aşamalarında detaylı gen fonksiyonlarını anlamak yardımcı olacak bu stratejinin genel bir uygulama önerilir.
Introduction
Eritrosit oluşumu, eritrositler olgunlaşması için multipotent hematopoetik kök hücrelerin farklılaşması işlemidir. Bu kademeli işlem, ilgili eritroid patlama oluşturan birimler (BFU-Es), hızla bölünen eritroid koloni oluşturan birimler (CFU-Es) ve morfolojik olarak algılanabilen birçok eritroblast 1,2 oluşumunu kapsamaktadır. CFU-E projenitör hücrelerin Terminal eritropoezis sıralı eritropoietin bağımlı ve bağımsız aşamaları 2,3 içerir. Terminal eritropoezi erken aşamasında, eritropoetin (EPO), hücre yüzeyi üzerinde kendi reseptörüne bağlanan ve hücre apoptozu önlemez ve hızlı hücre bölünmesi ve gen ekspresyonunu teşvik 1,4 aşağı doğru sinyal yollarının bir dizi yol açar. Terminal eritropoezin geç evrede, Eritroblastlar derece yoğun çekirdeklerin 5 terminali hücre döngüsü çıkmak, kromatin ve çekirdek yoğunlaşmayı ve ekstrüzyon tabi.
Terminalin anlayışımızeritropoezis sayesinde büyük ölçüde in vitro birkaç başarılı kullanımı ve in vivo fare modellerinde 6-9 büyük ölçüde son birkaç on yıl içinde artmıştır. Bu modeller arasında, fare, fetal karaciğer eritroblast vitro kültür içinde hücre arıtma için hızlı çoğalma ve farklılaşma dahil olmak üzere birçok avantaj kolaylığı sağlar ve insan erythropoiesis 10,11 yakından taklit eder. Bu sistemde, fare fetal dokulardan eritroid progenitör hücrelerin çok sayıda kolay Ter119 tek aşamada arıtıldıktan (olgun eritroid hücreler için bir işaret) negatif eritroblast izole edilebilir. Eritroblast iki günlük kültür boyunca, bu, hücrelerin farklılaşması Transferin reseptörüne (CD71) ve Ter119 antijenin 12 yüzey ifadesine dayalı akış sitometrik analizi ile izlenebilir. Buna ek olarak, terminal farklılaşma eritroblast enükleasyonu 1 bir DNA makinesi (Hoechst 33342) tarafından tespit edilebilir3. Bundan başka, arıtılmış ataları genetik olarak cDNA veya erythropoiesis 11,13,14 gen ekspresyonunun fonksiyonlarının mekanistik çalışmalar kolaylaştırır ve ilgilenilen genler için, küçük bir saç tokası RNA (shRNAs) eksojen ekspresyonu ile modifiye edilebilir.
Bu terminali eritropoezin farklı aşamalarında gen işlevleri tanımlamak zor olduğundan, diğer taraftan, hızlı hücre büyüme oranı iki ucu keskin kılıç olabilir. Çoğu durumda, bu cDNA'lar veya shRNAs ifade zaman terminalinde eritropoezi erken aşamasında belirli bir gen fonksiyonları, hücreler daha önce ilk aşamayı belirlemek zordur. Bu sorunu çözmek için, biz terminali eritropoezin erken ve geç evreleri incelemek için eşsiz bir sistem geliştirdi. Terminal eritropoezi erken bir aşaması için, genetik olarak tadil edilmiş Ter119 negatif Eritroblastlar EPO içermeyen ortam içeren ama kök hücre faktörü (SCF), IL-6 ve FLT3 kültürlendiligand kendi progenitör statüsünü korumak ve ifade 13 transdüse cDNA'lan veya shRNA izin vermek. Hücreler, hücre proliferasyonunu ve farklılaşmasını uyarmak için 12 saat sonra EPO ihtiva eden ortam ile değiştirildi. Hücrelerin ayırt başladı Bu şekilde, transduse ya da cDNA'lar shRNAs daha önce ifade edildi. Terminal eritropoezi geç aşaması için, negatif Ter119 Eritroblastlar EPO transdüksiyon sonra hemen sıvı ihtiva eden kültürlenmiştir. Bu nedenle, bir terminal eritropoezi geç evrede, ilgi konusu genlerin fonksiyonlarının analiz edebilir. Özetle, bu sistemin geniş bir uygulama terminali eritropoezin farklı aşamalarında teşrih gen fonksiyonlarını yardımcı olacaktır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada kronolojik fare fetal karaciğer terminali eritropoezi analiz etmek için eşsiz bir sistem sunuyoruz. Farklı kültür koşulları uygulama sayesinde, başarıyla erken ve geç evrelerinde terminal eritropoezi disseke. Bu çok işlevli genlerin mekanizmaların belirlenmesi özellikle önemlidir. Örneğin, Rac GTPazlar terminali eritropoezin farklı aşamalarında önemli rol oynar. Terminal eritropoezis etkiler, hücre farklılaşması ve çoğalması erken evrede Rac GTPases engellenmesi. Diğer yandan, hücre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma NIH R00HL102154 tarafından desteklenen ve P Ji Hematoloji bilim adamı ödülü bir Amerikan Derneği oldu.
Materials
| Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
| b-mecaptoethanol | Sigma | M6250 | 0.1 M in IMDM, 4℃stock |
| Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100 X |
| L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
| Stem cell factor (SCF) | STEMCELL TECH | 2630 | 100 ng/ul, -20℃ stock |
| Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
| Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
| fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
| Insulin solution, human | Sigma | I9278 | 4℃ stock |
| holo-transferrin human | Sigma | T0665 | 50 mg/ml in Water -20℃ stock |
| Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
| Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
| EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
| Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |
References
- Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
- Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
- Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
- Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
- Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
- Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
- Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
- Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
- Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
- Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
- Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
- Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
- Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
- Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
- Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
- Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
- Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. New insights into erythropoiesis. Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).
