Summary

Rato Fetal Liver Sistema de Cultura de dissecar Funções gene alvo nas fases precoces e tardias da Terminal Eritropoiese

Published: September 09, 2014
doi:

Summary

Nós apresentamos um rato fetal sistema de cultura in vitro de eritroblastos fígado que disseca os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Este sistema facilita a análise funcional de genes específicos em diferentes estágios de desenvolvimento.

Abstract

Eritropoiese envolve um processo dinâmico que começa com unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES) seguido de divisão rápida erythroid unidades formadoras de colônia (UFC-Es). Depois de CFU-Es, as células são morfologicamente reconhecíveis e geralmente denominado eritroblastos terminais. Um dos desafios para o estudo da eritropoiese terminal é a falta de abordagens experimentais para dissecar as funções dos genes de uma forma cronológica. Neste protocolo, descrevemos uma estratégia única para determinar as funções dos genes nas fases precoces e tardias da eritropoiese terminal. Neste sistema, rato fetal Ter119 fígado (marcador de células eritróides maduras) eritroblastos negativos foram purificados e transduzidas com expressão exógena de cDNAs ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse. As células foram posteriormente cultivadas em outras que a eritropoietina (Epo) para manter a sua fase progenitoras, durante 12 horas, permitindo que os cDNAs exógenos ou shRNAs um meio contendo factores de crescimentopara expressar. As células foram mudadas para meio de EPO depois de 12 horas para induzir a diferenciação e proliferação celular, enquanto os materiais genéticos exógenos, já foram expressos. Este protocolo facilita a análise de funções de genes na fase inicial da eritropoiese terminal. Para estudar tarde fase terminal eritropoiese, as células foram cultivadas em meio imediatamente após a transdução de Epo. Desta forma, as células já foram diferenciadas para a fase tardia da eritropoiese terminal quando os materiais genéticos transduzidas foram expressos. Recomendamos a aplicação geral desta estratégia que ajudaria a entender as funções dos genes detalhadas em diferentes estágios de eritropoiese terminal.

Introduction

Eritropoiese é o processo de diferenciação de células-tronco hematopoiéticas multipotentes para amadurecer eritrócitos. Este processo gradual inclui a formação de unidades formadoras empenhados explosão eritróide (UFB-ES), os que se dividem rapidamente unidades formadoras de colônias eritróides (UFC-ES), e morfologicamente eritroblastos reconhecíveis 1,2. Eritropoiese Terminal a partir de células progenitoras CFU-E envolve sequencial estágios independentes 2,3-dependente e eritropoietina. Na fase inicial da eritropoiese terminal, eritropoietina (Epo) se liga ao seu receptor na superfície da célula e induz uma série de vias de sinalização a jusante que previnem a apoptose celular e promovem a divisão celular rápida e de 1,4 a expressão do gene. No final da fase de eritropoiese terminal, eritroblastos submeter saída do terminal ciclo celular, condensação de cromatina e núcleo, e extrusão dos núcleos altamente condensadas 5.

Nossa compreensão do terminal deeritropoiese tem melhorado muito nas últimas décadas, que é em grande parte devido ao sucesso do uso de vários in vitro e in vivo de mouse 6-9. Entre estes modelos, a cultura in vitro de rato fetal eritroblastos fígado proporciona muitas vantagens, incluindo a facilidade de purificação de células, proliferação e diferenciação rápida, e um mímico mais perto da eritropoiese humano 10,11. Neste sistema, um grande número de células progenitoras eritróides a partir de fígados de rato fetais pode ser facilmente isolado por purificação a única etapa de Ter119 (um marcador para as células eritróides maduras) eritroblastos negativos. Durante a cultura de dois dias dos eritroblastos, a diferenciação destas células podem ser monitorizados por uma análise de citometria de fluxo com base na expressão de superfície do receptor de transferrina (CD71) e o antigénio Ter119 12. Além disso, a enucleação dos eritroblastos de diferenciação terminal pode ser detectada por uma máquina de ADN (Hoechst 33342) 13. Além disso, as células progenitoras purificadas, pode ser geneticamente modificada por expressão de ADNc exógeno ou pequenas hairpin RNAs (shRNAs) para os genes de interesse, o que facilita os estudos mecanicistas das funções de expressão do gene na eritropoiese 11,13,14.

Por outro lado, a rápida taxa de crescimento celular podem ser uma espada de dois gumes, uma vez que é difícil de caracterizar as funções de genes em diferentes fases da eritropoiese terminal. Na maioria dos casos, é difícil determinar se a funções de genes específicos na fase precoce da eritropoiese terminal de desde pelo tempo que o ADNc ou shRNAs expressa, as células já passou da fase precoce. Para resolver este problema, foi desenvolvido um sistema único para dissecar os estágios iniciais e tardios da eritropoiese terminal. Para a fase inicial da eritropoiese terminal, geneticamente modificados Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio livre de Epo, mas que contém o factor de células estaminais (SCF), IL-6 e FLT3ligante para manter seu status progenitor e permitir que os cDNAs transduzidas ou shRNA a expressão 13. As células foram mudadas para meio contendo EPO depois de 12 horas para induzir a proliferação e diferenciação celular. Desta forma, quando as células se diferenciaram, os cDNAs foram transduzidas ou shRNAs já expressa. Para o estágio tardio da eritropoiese terminal, Ter119 eritroblastos negativas foram cultivadas em meio contendo EPO, imediatamente após a transdução. Portanto, pode-se analisar as funções dos genes de interesse na fase tardia da eritropoiese terminal. Em resumo, uma ampla aplicação deste sistema ajudaria funções dos genes dissecar em diferentes estágios de eritropoiese terminal.

Protocol

Os experimentos descritos neste protocolo foram realizados de acordo com as diretrizes e regulamentos estabelecidos pela Universidade Northwestern Animal Care Institucional e Comitê de Uso. 1 Preparação de Meio de Cultura Preparar a solução de fibronectina. Adicionar 1 ml de água para um frasco de fibronectina humana (1 mg). Deixar solução em cultura da capa de tecido, durante 30 minutos, sem agitação. Transferir o líquido total a 50 ml de PBS para fazer uma concentraç…

Representative Results

A Figura 1 descreve as estratégias experimentais. O protocolo consiste em duas condições independentes para alvejar as funções das moléculas sinalizadoras nas fases precoce e tardia da eritropoiese terminal. Ter119 eritroblastos de fígado fetal negativos foram purificados a partir do rato E13.5 feto. A análise por citometria de fluxo de células eritróides fetais de fígado antes e após purificação demonstrado que a purificação foi eficiente (Figuras 2A e 2B).</str…

Discussion

Aqui apresentamos um sistema único para analisar cronologicamente rato fetal eritropoiese terminal de fígado. Através da aplicação de diferentes condições de cultivo, dissecamos sucesso eritropoiese terminais em fases precoces e tardias. Isto é particularmente importante para determinar os mecanismos de genes com funções múltiplas. Por exemplo, GTPases Rac desempenham papéis importantes em diferentes estágios de eritropoiese terminal. Inibição de Rac GTPases na fase inicial de diferenciação e prolifera?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudo foi financiado pelo NIH R00HL102154, e um da American Society of Hematology prêmio estudioso a P Ji.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) Gibco 12440-053
Fetal bovine serum (FBS) GEMINI Bio-product 700-102P
b-mecaptoethanol Sigma M6250 0.1 M in IMDM,  4℃stock
Penicillin-Streptomycin solution Hyclone SV30010 100 X
L-Glutamine Hyclone SH30034.01 200 mM
Stem cell factor (SCF) STEMCELL TECH 2630 100 ng/ul, -20℃ stock
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) BD Biosciences  14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)  GEMINI Bio-product 300-327P
fibronectin BD Biosciences  354008
Bovine Serum Albumin (BSA) STEMCELL TECH 9300 10% stock in IMDM
Insulin solution, human Sigma I9278 4℃ stock
holo-transferrin human Sigma T0665 50 mg/ml in Water -20℃ stock
Erythropoietin(Epo) PROCRIT NOC 59676-303-00 3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus BD Pharmingen 557812
EasySep Magnet STEMCELL TECH 18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml FALCON 352063

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Cite This Article
Zhao, B., Mei, Y., Yang, J., Ji, P. Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis. J. Vis. Exp. (91), e51894, doi:10.3791/51894 (2014).

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