نقدم في المختبر الماوس الجنين نظام الثقافة أرومة الحمراء الكبد أن يشرح المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. هذا النظام يسهل التحليل الوظيفي للجينات محددة في مراحل النمو المختلفة.
ينطوي الكريات الحمر عملية ديناميكية التي تبدأ مع وحدات ملتزمة محمر انفجار تشكيل (الاتحاد البلغاري في Es-)، يليه تقسيم بسرعة محمر مستعمرة (كفو-الخانات). بعد كفو-ES، الخلايا هي معترف بها شكليا ويسمى عموما الأرومة الحمراء الطرفية. واحدة من التحديات لدراسة الكريات الحمر المحطة هو عدم وجود مناهج تجريبية لتشريح وظائف الجينات بطريقة متسلسلة زمنيا. في هذا البروتوكول، ونحن تصف استراتيجية فريدة من نوعها لتحديد وظائف الجينات في المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. في هذا النظام، وتنقيته الماوس TER119 كبد الجنين (محمر ناضجة خلية علامة) الأرومة الحمراء السلبية وtransduced مع التعبير خارجي من cDNAs أو الرنا دبوس صغير (shRNAs) للجينات الفائدة. ومثقف الخلايا بعد ذلك في عوامل النمو الأخرى من المتوسط تحتوي الإريثروبويتين (EPO) للحفاظ على مرحلة السلف لمدة 12 ساعة بينما يسمح للcDNAs الخارجية أو shRNAsللتعبير. تم تغيير الخلايا لإبو المتوسطة بعد 12 ساعة للحث على تمايز الخلايا وانتشارها في حين أعرب عن المواد الوراثية خارجية بالفعل. هذا البروتوكول يسهل تحليل وظائف الجينات في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة. لدراسة المرحلة المتأخرة محطة الكريات الحمر، تم زرعها في خلايا فورا إبو المتوسطة بعد ترنسدوكأيشن. وبهذه الطريقة، كانت خلايا متباينة بالفعل إلى مرحلة متأخرة من الكريات الحمر عند محطة وأعرب عن المواد الوراثية transduced. نوصي التطبيق العام لهذه الاستراتيجية التي من شأنها أن تساعد على فهم وظائف الجينات مفصلة في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة.
الكريات الحمر هي عملية تمايز الخلايا الجذعية المكونة للدم متعددة القدرات لتنضج كرات الدم الحمراء. وتشمل هذه العملية تدريجية تشكيل وحدات تشكيل ملتزمة محمر انفجار (الاتحاد البلغاري-ES) وعلى سرعة تقسيم الوحدات محمر تشكيل مستعمرة (كفو-ES) وشكليا والأرومة الحمراء التعرف 1،2. الكريات الحمر محطة من الخلايا الاولية كفو-E-إرثروبويتين ينطوي متتابعة تعتمد ومراحل مستقلة 2،3. في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة، هرمون الإيريثروبويتين تربط لمستقبلات على سطح الخلية ويدفع سلسلة من مسارات إشارات المصب التي تمنع موت الخلايا المبرمج الخلية وتعزيز الانقسامات الخلوية السريعة والتعبير الجيني 1،4. في مرحلة متأخرة من الكريات الحمر المحطة، الأرومة الحمراء الخضوع دورة الخلية الطرفية الخروج، لونين والتكثيف النواة، وقذف نوى مكثف للغاية 5.
فهمنا للمحطةالكريات الحمر قد تحسنت كثيرا في العقود القليلة الماضية، والتي هي إلى حد كبير بسبب نجاح استخدام عدة في المختبر وفي الجسم الحي نماذج الماوس 6-9. من بين هذه النماذج، في الثقافة المختبر من الماوس الجنين الأرومة الحمراء الكبد يوفر العديد من المزايا بما في ذلك سهولة تنقية الخلايا، والانتشار السريع والتمايز، وأقرب إلى تقليد الكريات الحمر البشري 10،11. في هذا النظام، وأعداد كبيرة من الخلايا محمر السلف من الماوس كبد الجنين يمكن عزلها بسهولة عن طريق تنقية خطوة واحدة من TER119 (علامة للخلايا ناضجة محمر) الأرومة الحمراء السلبية. خلال ثقافة لمدة يومين من الأرومة الحمراء، والتفريق بين هذه الخلايا يمكن رصدها من خلال تحليل تدفق cytometric على أساس التعبير سطح مستقبلات ترانسفيرين (CD71) والمستضد TER119 12. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يتم الكشف عن قلع من الأرومة الحمراء عضال التمايز بواسطة صانع الحمض النووي (هويشت 33342) 13. وعلاوة على ذلك، فإن الأسلاف المنقى يمكن تعديلها وراثيا عن طريق التعبير خارجي من cDNAs أو الرنا دبوس صغير (shRNAs) للجينات الفائدة، مما يسهل الدراسات الميكانيكية للمهام التعبير الجيني في الكريات الحمر 11،13،14.
من ناحية أخرى، يمكن أن معدل نمو الخلايا سريع يكون سيفا ذا حدين لأنه من الصعب لتوصيف وظائف الجينات في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة. في معظم الحالات، فإنه من الصعب تحديد ما إذا كان الجين وظائف محددة في مرحلة مبكرة من الكريات الحمر المحطة منذ بحلول الوقت أعرب عن cDNAs أو shRNAs، الخلايا مرت بالفعل في مرحلة مبكرة. لحل هذه المشكلة، قمنا بتطوير نظام فريد لتشريح المراحل المبكرة والمتأخرة من الكريات الحمر المحطة. للمرحلة الأولى من محطة الكريات الحمر، وكانت معدلة وراثيا TER119 الأرومة الحمراء السلبية مثقف في المتوسط مجانا إبو ولكن تحتوي على الخلايا الجذعية عامل (SCF)، IL-6 و FLT3يجند للحفاظ على حالة السلف وتسمح cDNAs transduced أو shRNA التعبير 13. تم تغيير الخلايا لإبو تحتوي على المتوسط بعد 12 ساعة للحث على تكاثر الخلايا والتمايز. في هذه الطريقة، عندما بدأت خلايا للتمييز، وأعرب بالفعل cDNAs transduced أو shRNAs. لمرحلة متأخرة من الكريات الحمر محطة، كانت TER119 الأرومة الحمراء السلبية المستزرعة في إبو تحتوي على المتوسط مباشرة بعد ترنسدوكأيشن. وبالتالي، يمكن للمرء أن تحليل وظائف الجينات من الاهتمام في مرحلة متأخرة من الكريات الحمر المحطة. وباختصار، فإن التطبيق الواسع لهذا النظام يساعد على وظائف الجينات تشريح في مراحل مختلفة من الكريات الحمر المحطة.
هنا نقدم نظام فريد لتحليل زمنيا الماوس الجنين تكون الكريات الحمر محطة الكبد. من خلال تطبيق الشروط ثقافة مختلفة، ونحن تشريح بنجاح الكريات الحمر محطة في المراحل المبكرة والمتأخرة. هذا مهم بشكل خاص لتحديد آليات الجينات مع وظائف متعددة. على سبيل المثال، GTPases RAC تلعب أدوا?…
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة R00HL102154، والجمعية الأمريكية لأمراض الدم جائزة الباحث إلى P جي.
Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) | Gibco | 12440-053 | |
Fetal bovine serum (FBS) | GEMINI Bio-product | 700-102P | |
b-mecaptoethanol | Sigma | M6250 | 0.1 M in IMDM, 4℃stock |
Penicillin-Streptomycin solution | Hyclone | SV30010 | 100 X |
L-Glutamine | Hyclone | SH30034.01 | 200 mM |
Stem cell factor (SCF) | STEMCELL TECH | 2630 | 100 ng/ul, -20℃ stock |
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) | BD Biosciences | 14-8001-80 | |
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6) | GEMINI Bio-product | 300-327P | |
fibronectin | BD Biosciences | 354008 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | STEMCELL TECH | 9300 | 10% stock in IMDM |
Insulin solution, human | Sigma | I9278 | 4℃ stock |
holo-transferrin human | Sigma | T0665 | 50 mg/ml in Water -20℃ stock |
Erythropoietin(Epo) | PROCRIT | NOC 59676-303-00 | 3,000 U/ml stock |
Streptavidin particles Plus | BD Pharmingen | 557812 | |
EasySep Magnet | STEMCELL TECH | 18000 | |
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml | FALCON | 352063 |