Summary

Souris foie fœtal Système de culture à disséquer les fonctions du gène cible dans les stades précoces et tardifs de l'aérogare de l'érythropoïèse

Published: September 09, 2014
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Summary

Nous présentons un système in vitro de culture de fœtus de souris des érythroblastes de foie qui dissèque les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Ce système facilite l'analyse fonctionnelle des gènes spécifiques à différents stades de développement.

Abstract

Érythropoïèse implique un processus dynamique qui commence avec des unités engagées en rafale érythroïde formant (BFU-Es) puis en divisant rapidement érythroïde unités formant colonie (UFC-Es). Après CFU-E, les cellules sont morphologiquement reconnaissable et généralement appelée érythroblastes terminaux. L'un des défis pour l'étude de l'érythropoïèse terminale est le manque d'approches expérimentales pour disséquer les fonctions des gènes d'une manière chronologique. Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie unique pour déterminer la fonction des gènes dans les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Dans ce système, la souris fœtale Ter119 du foie (marqueur des cellules érythroïdes matures) des érythroblastes négatifs ont été purifiés et transduites avec l'expression exogène d'ADNc ou de petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) pour les gènes d'intérêt. Les cellules ont ensuite été cultivées dans des facteurs de croissance de milieu contenant d'autres de l'érythropoïétine (Epo) pour maintenir leur stade de progéniteurs pendant 12 heures tout en laissant les ADNc exogène ou shRNAà exprimer. Les cellules ont été modifiées pour Epo milieu après 12 heures pour induire la différenciation et la prolifération cellulaire, tandis que les matériaux génétiques exogènes ont déjà été exprimés. Ce protocole facilite l'analyse des fonctions des gènes dans le stade précoce de l'érythropoïèse terminale. Pour étudier la fin de l'érythropoïèse terminale de stade, les cellules ont été immédiatement mises en culture dans un milieu Epo après transduction. De cette manière, les cellules ont été déjà différenciées à la fin du stade de l'érythropoïèse terminale lorsque les matériaux génétiques transduites ont été exprimés. Nous recommandons une application générale de cette stratégie qui aiderait à comprendre les fonctions des gènes détaillées à différents stades de l'érythropoïèse terminale.

Introduction

L'érythropoïèse est le processus de différenciation de cellules souches hématopoïétiques multipotentes à maturité érythrocytes. Ce processus par étapes comprend la formation d'unités engagées en rafale érythroïde formant (BFU-E), les unités formant des colonies érythroïdes à division rapide (CFU-Es), et morphologiquement reconnaissables érythroblastes 1,2. Érythropoïèse terminale à partir de cellules souches CFU-E implique séquentielle érythropoïétine-dépendantes et indépendantes étapes 2,3. Dans le stade précoce de l'érythropoïèse terminale, l'érythropoïétine (EPO) se lie à son récepteur sur la surface cellulaire et induit une série de voies de signalisation en aval qui empêchent l'apoptose cellulaire et favorisent la division cellulaire rapide et l'expression du gène 1,4. À la fin du stade de l'érythropoïèse terminale, érythroblastes subissent sortie de la cellule terminale du cycle, de la chromatine et de noyaux de condensation, et l'extrusion des noyaux fortement condensés 5.

Notre compréhension de la borneérythropoïèse s'est grandement améliorée au cours des dernières décennies, ce qui est dû en grande partie à l'utilisation réussie de plusieurs in vitro et dans des modèles murins in vivo 6-9. Parmi ces modèles, la culture in vitro de souris fœtale érythroblastes de foie fournit de nombreux avantages, y compris la facilité de purification des cellules, la prolifération et la différenciation rapide, et un synoptique plus proche de l'érythropoïèse 10,11 humain. Dans ce système, un grand nombre de cellules progénitrices érythroïdes à partir de foie fœtal de souris peuvent être facilement isolés par la purification en une seule étape de Ter119 (un marqueur pour les cellules érythroïdes matures) des érythroblastes négatifs. Au cours de la culture de deux jours des érythroblastes, la différenciation de ces cellules peut être surveillée par une analyse par cytométrie de flux sur la base de l'expression en surface du récepteur de la transferrine (CD71) et l'antigène de Ter119 12. En outre, des érythroblastes énucléation de différenciation terminale peut être détectée par un fabricant de l'ADN (Hoechst 33 342) 13. En outre, les progéniteurs purifiés peuvent être génétiquement modifiées par expression d'ADNc exogène ou de petits ARN en épingle à cheveux (shRNA) pour les gènes d'intérêt, ce qui facilite les études mécanistiques des fonctions de l'expression du gène sur l'érythropoïèse 11,13,14.

D'autre part, le taux de croissance de cellule rapide peut être une arme à double tranchant, car il est difficile de caractériser les fonctions des gènes à différents stades de l'érythropoïèse terminale. Dans la plupart des cas, il est difficile de déterminer si une des fonctions des gènes spécifiques à un stade précoce de l'érythropoïèse terminale depuis le temps des ADNc ou shRNA exprimés, les cellules ont déjà passé le stade précoce. Pour résoudre ce problème, nous avons développé un système unique pour disséquer les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Pour le stade précoce de l'érythropoïèse terminale, Ter119 érythroblastes négatifs génétiquement modifiés ont été cultivées dans un milieu sans Epo mais contenant du facteur de cellules souches (SCF), l'IL-6 et FLT3ligand de maintenir leur statut de géniteur et laissez les ADNc transduites ou shRNA à l'expression 13. Les cellules ont été modifiées pour l'Epo contenant le milieu après 12 heures pour induire la prolifération et la différenciation cellulaire. De cette façon, lorsque les cellules ont commencé à se différencier, les ADNc ont été transduites ou shRNA déjà exprimé. Pour la phase tardive de l'érythropoïèse terminale, Ter119 érythroblastes négatives ont été cultivées dans un milieu contenant de l'Epo immédiatement après la transduction. Par conséquent, on peut analyser les fonctions des gènes d'intérêt dans la phase tardive de l'érythropoïèse terminale. En résumé, une large application de ce système aiderait les fonctions des gènes disséquer à différents stades de l'érythropoïèse terminale.

Protocol

Les expériences décrites dans ce protocole ont été réalisées en conformité avec les directives et règlements établis par l'Université Northwestern institutionnel de protection des animaux et l'utilisation Comité. 1 Préparation du milieu de culture Préparer la solution de fibronectine. Ajouter 1 ml d'eau à une fiole de la fibronectine humaine (1 mg). Laissez solution dans la culture de tissus capot pendant 30 minutes sans agitation. Transférer le liquide …

Representative Results

La figure 1 présente les stratégies expérimentales. Le protocole est constitué de deux conditions indépendantes pour viser les fonctions des molécules de signalisation dans les stades précoces et tardifs de l'érythropoïèse terminale. Ter119 négatifs érythroblastes de foie foetal ont été purifiés à partir de fœtus de souris E13.5. Analyse par cytométrie de flux de cellules érythroïdes fœtales du foie avant et après purification a montré que la purification a été efficace <str…

Discussion

Nous présentons ici un système unique d'analyser chronologiquement fœtus de souris érythropoïèse terminale du foie. Grâce à l'application de différentes conditions de culture, nous avons disséqué avec succès l'érythropoïèse terminale en début et en fin. Ceci est particulièrement important pour déterminer les mécanismes de gènes ayant des fonctions multiples. Par exemple, GTPases Rac jouent un rôle important dans les différentes étapes de l'érythropoïèse terminale. L'inhibiti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Cette étude a été soutenue par le NIH R00HL102154, et un American Society of Hematology prix de savant à P Ji.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) Gibco 12440-053
Fetal bovine serum (FBS) GEMINI Bio-product 700-102P
b-mecaptoethanol Sigma M6250 0.1 M in IMDM,  4℃stock
Penicillin-Streptomycin solution Hyclone SV30010 100 X
L-Glutamine Hyclone SH30034.01 200 mM
Stem cell factor (SCF) STEMCELL TECH 2630 100 ng/ul, -20℃ stock
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) BD Biosciences  14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)  GEMINI Bio-product 300-327P
fibronectin BD Biosciences  354008
Bovine Serum Albumin (BSA) STEMCELL TECH 9300 10% stock in IMDM
Insulin solution, human Sigma I9278 4℃ stock
holo-transferrin human Sigma T0665 50 mg/ml in Water -20℃ stock
Erythropoietin(Epo) PROCRIT NOC 59676-303-00 3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus BD Pharmingen 557812
EasySep Magnet STEMCELL TECH 18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml FALCON 352063

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Cite This Article
Zhao, B., Mei, Y., Yang, J., Ji, P. Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis. J. Vis. Exp. (91), e51894, doi:10.3791/51894 (2014).

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