Summary

Мышь фетальной печени Культура Система рассекать гена-мишени Функции на ранних и поздних стадиях терминала эритропоэза

Published: September 09, 2014
doi:

Summary

Мы представляем в пробирке мыши плода систему культуры эритробласт печени, что рассекает ранние и поздние этапы терминала эритропоэза. Эта система облегчает функциональный анализ специфических генов в разных стадиях развития.

Abstract

Эритропоэз включает динамический процесс, который начинается с решимости эритроидная пакетных единиц (БОЕ-ES) с последующим быстро делящиеся эритроидного колониеобразующих единиц (КОЕ-ES). После КОЕ-Эс, клетки морфологически узнаваемым и обычно называют терминальные эритробласты. Одна из проблем для изучения терминала эритропоэза является отсутствие экспериментальных подходов рассекать функций генов в хронологическом порядке. В этом протоколе, мы описываем уникальную стратегию, чтобы определить функции генов в ранних и поздних стадиях терминального эритропоэза. В этой системе, мышь плода Ter119 печени (маркер зрелых эритроидных клеток) отрицательные эритробластов очищали и трансдуцированных экзогенной экспрессии кДНК или малых РНК шпильки (shRNAs) для интересующих генов. Затем клетки культивировали в среде, содержащей факторы роста других, чем эритропоэтин (ЕРО), чтобы поддерживать их предшественников этап в течение 12 часов, позволяя экзогенные кДНК или shRNAsвыразить. Клетки были изменены на Epo среды после 12 часов, чтобы индуцировать дифференцировку и пролиферацию клеток, а экзогенные генетические материалы были уже выражены. Этот протокол облегчает анализ генных функций в ранней стадии терминального эритропоэза. Для изучения поздно терминала эритропоэз стадии, клетки немедленно культивировали в Эпо среду после трансдукции. Таким образом, эти клетки уже дифференцированы в поздней стадии эритропоэза терминала, когда были выражены трансдуцированных генетические материалы. Мы рекомендуем общее применение этой стратегии, которая помогла бы понять подробные функций генов в различных стадиях терминала эритропоэза.

Introduction

Эритропоэза является процесс дифференциации мультипотентных гемопоэтических стволовых клеток в зрелые эритроциты. Это поэтапный процесс включает в себя формирование привержены эритроидная пакетных единиц (БОЕ-ES), быстро делящиеся эритроидные колониеобразующих единиц (КОЕ-Эс), и морфологически распознаваемых эритробластов 1,2. Терминал эритропоэз из клеток-предшественников CFU-E включает в себя последовательную эритропоэтин-зависимые и независимые этапы 2,3. На ранней стадии терминального эритропоэза, эритропоэтин (ЕРО) связывается со своим рецептором на поверхности клетки и индуцирует серию последующих сигнальных путей, которые предотвращают апоптоз клеток и способствуют быстрому клеточных делений и экспрессию гена 1,4. В поздней стадии терминального эритропоэза, эритробласты пройти выход терминал клеточного цикла, хроматин и ядра конденсации, и экструзию высоко конденсированных ядер 5.

Наше понимание терминалаэритропоэз значительно улучшилась за последние несколько десятилетий, что во многом благодаря успешному использованию нескольких в пробирке и в естественных мышиных моделях 6-9. Среди этих моделей, в пробирке культуру мыши плода эритробластов печени предоставляет много преимуществ, включая простоту очистки клеток, быстро пролиферации и дифференцировки, и ближе имитировать человеческой эритропоэза 10,11. В этой системе, большое количество клеток-предшественников эритроидного от мыши печени плода может быть легко изолированы от одной стадии очистки Ter119 (маркер для зрелых эритроидных клеток) негативных эритробластов. В течение двух дней культуры эритробластов, дифференцировки этих клеток можно контролировать с помощью проточной цитометрии анализа, основанного на поверхностной экспрессии рецептора трансферрина с (CD71) и Ter119 антигена 12. Кроме того, энуклеации из терминальной дифференцировки эритробластов могут быть обнаружены с помощью ДНК-производителя (Hoechst 33342) 13. Кроме того, очищенные предшественники могут быть генетически модифицированы экзогенного выражения кДНК или малых РНК шпильки (shRNAs) для интересующих генов, что облегчает механистические исследования функций экспрессии генов на эритропоэз 11,13,14.

С другой стороны, высокая скорость роста клеток может быть обоюдоострым оружием, так как трудно характеризуют функции генов в различных стадиях терминала эритропоэза. В большинстве случаев, трудно определить, является ли конкретные функции генов в ранней стадии терминального эритропоэза так как по времени кДНК или shRNAs выраженной, клетки уже прошли раннюю стадию. Чтобы решить эту проблему, мы разработали уникальную систему, чтобы вскрыть ранние и поздние этапы терминала эритропоэза. Для ранней стадии терминала эритропоэза, генетически модифицированные Ter119 отрицательные эритробластов культивировали в EPO-свободного среды, но содержащий фактор стволовых клеток (SCF), ИЛ-6 и FLT3лиганд сохранить свой ​​статус предшественников и позволяют трансдуцированных кДНК или ShRNA выражению 13. Клетки были изменены на Epo, содержащей среду после 12 часов, чтобы индуцировать пролиферацию и дифференцировку клеток. Таким образом, когда клетки начали дифференцироваться, уже выразили трансдуцированных кДНК или shRNAs. Для поздней стадии терминального эритропоэза, Ter119 отрицательные эритробласты культивировали в ЭПО сразу среде, содержащей после трансдукции. Таким образом, можно проанализировать функции генов, представляющих интерес в поздней стадии терминального эритропоэза. Таким образом, широкое применение этой системы поможет рассекать функций генов в различных стадиях терминала эритропоэза.

Protocol

Эксперименты, описанные в этом протоколе были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами, установленными Северо-Западного университета Уходу за животными и использованию комитета. 1 Получение культуральной среде Подготовьте фибронектина ре?…

Representative Results

Рисунок 1 описывает экспериментальные стратегии. Протокол состоит из двух независимых условий для таргетинга функции сигнальных молекул в ранних и поздних стадиях терминального эритропоэза. Ter119 отрицательные плода эритробласты печени были очищены от E13.5 мыши плода. Проточн?…

Discussion

Здесь мы представляем уникальную систему, чтобы хронологически проанализировать мыши плода терминала печени эритропоэз. За счет применения различных условиях культивирования, мы успешно расчлененный терминала эритропоэз в ранних и поздних стадиях. Это особенно важно, чтобы определ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Это исследование было поддержано NIH R00HL102154, и Американского общества гематологии ученого премии в P Джи.

Materials

Iscove's Modified Dulbecco's MediumIMDM (IMDM) Gibco 12440-053
Fetal bovine serum (FBS) GEMINI Bio-product 700-102P
b-mecaptoethanol Sigma M6250 0.1 M in IMDM,  4℃stock
Penicillin-Streptomycin solution Hyclone SV30010 100 X
L-Glutamine Hyclone SH30034.01 200 mM
Stem cell factor (SCF) STEMCELL TECH 2630 100 ng/ul, -20℃ stock
Mouse FIT3 Ligand (Flt-3L) BD Biosciences  14-8001-80
Mouse Recombinant Interleukin-6 (IL-6)  GEMINI Bio-product 300-327P
fibronectin BD Biosciences  354008
Bovine Serum Albumin (BSA) STEMCELL TECH 9300 10% stock in IMDM
Insulin solution, human Sigma I9278 4℃ stock
holo-transferrin human Sigma T0665 50 mg/ml in Water -20℃ stock
Erythropoietin(Epo) PROCRIT NOC 59676-303-00 3,000 U/ml stock
Streptavidin particles Plus BD Pharmingen 557812
EasySep Magnet STEMCELL TECH 18000
Polypropylene Round-Bottom Tube, 5 ml FALCON 352063

References

  1. Hattangadi, S. M., Wong, P., Zhang, L., Flygare, J., Lodish, H. F. From stem cell to red cell: regulation of erythropoiesis at multiple levels by multiple proteins, RNAs, and chromatin modifications. Blood. 118 (24), 6258-6268 (2011).
  2. Richmond, T. D., Chohan, M., Barber, D. L. Turning cells red: signal transduction mediated by erythropoietin. Trends in cell biology. 15 (3), 146-155 (2005).
  3. Eshghi, S., Vogelezang, M. G., Hynes, R. O., Griffith, L. G., Lodish, H. F. Alpha4beta1 integrin and erythropoietin mediate temporally distinct steps in erythropoiesis: integrins in red cell development. The Journal of cell biology. 177 (5), 871-880 (2007).
  4. Koury, M. J., Bondurant, M. C. Maintenance by erythropoietin of viability and maturation of murine erythroid precursor cells. Journal of cellular physiology. 137 (1), 65-74 (1988).
  5. Ji, P., Yeh, V., Ramirez, T., Murata-Hori, M., Lodish, H. F. Histone deacetylase 2 is required for chromatin condensation and subsequent enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts. Haematologica. 95 (12), 2013-2021 (2010).
  6. Dumitriu, B., et al. Sox6 cell-autonomously stimulates erythroid cell survival, proliferation, and terminal maturation and is thereby an important enhancer of definitive erythropoiesis during mouse development. Blood. 108 (4), 1198-1207 (2006).
  7. Rector, K., Liu, Y., Van Zant, G. Comprehensive hematopoietic stem cell isolation methods. Methods in molecular biology. 976, 1-15 (2013).
  8. Rossi, L., Challen, G. A., Sirin, O., Lin, K. K., Goodell, M. A. Hematopoietic stem cell characterization and isolation. Methods in molecular biology. 750, 47-59 (2011).
  9. Choi, H. S., Lee, E. M., Kim, H. O., Park, M. I., Baek, E. J. Autonomous control of terminal erythropoiesis via physical interactions among erythroid cells. Stem cell research. 10 (3), 442-453 (2013).
  10. Bhatia, H., et al. Short-chain fatty acid-mediated effects on erythropoiesis in primary definitive erythroid cells. Blood. 113 (25), 6440-6448 (2009).
  11. Zhang, J., Socolovsky, M., Gross, A. W., Lodish, H. F. Role of Ras signaling in erythroid differentiation of mouse fetal liver cells: functional analysis by a flow cytometry-based novel culture system. Blood. 102 (12), 3938-3946 (2003).
  12. Socolovsky, M., et al. Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts. Blood. 98 (12), 3261-3273 (2001).
  13. Ji, P., Jayapal, S. R., Lodish, H. F. Enucleation of cultured mouse fetal erythroblasts requires Rac GTPases and mDia2. Nature cell biology. 10 (3), 314-321 (2008).
  14. Chida, D., Miura, O., Yoshimura, A., Miyajima, A. Role of cytokine signaling molecules in erythroid differentiation of mouse fetal liver hematopoietic cells: functional analysis of signaling molecules by retrovirus-mediated expression. Blood. 93 (5), 1567-1578 (1999).
  15. Patel, V. P., Lodish, H. F. A fibronectin matrix is required for differentiation of murine erythroleukemia cells into reticulocytes. The Journal of cell biology. 105 (6 Pt 2), 3105-3118 (1987).
  16. Udupa, K. B., Lipschitz, D. A. Endotoxin-induced suppression of erythropoiesis: the role of erythropoietin and a heme synthesis stimulating factor. Blood. 59 (6), 1267-1271 (1982).
  17. Koury, M. J., Sawyer, S. T., Brandt, S. J. New insights into erythropoiesis. Current opinion in hematology. 9 (2), 93-100 (2002).

Play Video

Cite This Article
Zhao, B., Mei, Y., Yang, J., Ji, P. Mouse Fetal Liver Culture System to Dissect Target Gene Functions at the Early and Late Stages of Terminal Erythropoiesis. J. Vis. Exp. (91), e51894, doi:10.3791/51894 (2014).

View Video