Kan lökositleri ve trombosit bireyin genel bioenergetic sağlığının bir belirteci olarak kullanılır ve bu nedenle patolojik süreçlerin ve tedavilerin etkisini izlemek için bir potansiyele sahip olabilir. Burada mitokondriyal fonksiyonu ve bu hücrelerde oksidatif patlama izole etmek ve ölçmek için bir yöntem tarif eder.
Mitokondriyal işlev bozukluğu örneğin ateroskleroz, diyabet, septik şok, ve nörodejeneratif hastalıklar ama zordur hastalarda bioenergetic fonksiyonunda değişikliklere değerlendirilmesi gibi patolojik durumların bir çok önemli bir rol oynadığı bilinmektedir. , Diyabet ya da mevcut ateroskleroz gibi hastalıkların klinik spesifik organ yetmezliği, hiperglisemi ya da iltihap gibi patoloji sistemik bileşenleri, lökositler veya trombosit dolaşan bioenergetic işlevini değiştirebilir olsa da. Bu kavram, bir süre için kabul edilmiştir ancak yaygın uygulama bioenergetic analiz için gerekli birincil hücrelerin büyük sayısına göre kısıtlanmıştır. Bu teknik bir kısıtlama hücrelerin mikro aktivasyon olmadan bağlı izin manyetik boncuk ayırma teknikleriyle, hücre yapışma teknikleri özgünlüğünü birleştirerek üstesinden gelmek olmuştur ve yeni teknolojilerin hassasiyeti yüksek kapasiteli mikrofon için tasarlanmışroplate Respirometrik. Bu cihazın bir örneği dışı akı analizörü. Bu alet, tipik olarak daha sonra metabolizması ile ilgili olabilir yapışık hücrelerindeki bu parametreleri değişim oranlarını ölçmek için oksijen ve pH duyarlı probları kullanır. Burada ayrıntılı insan kanı ve bu hücrelerde mitokondriyal bioenergetic işlevinin analizi, aktivasyon olmaksızın, monositler, lemfositler, nötrofiller ve trombositlerin izolasyonu ve kaplama için YÖNTEM. Buna ek olarak, monositler ve nötrofillerde oksidatif patlama aynı örneklerde ölçülebilir gösterilmektedir. Bu yöntemler, sadece 8-20 ml insan kanı kullandıkları bir klinik ortamda reaktif oksijen türlerinin üretimi ve biyo enerjisini izleme için potansiyele sahiptir.
Bağışıklık hücreleri (monositler, lenfositler, nötrofiller) ve kandan trombositler bioenergetic sağlık izleme bireyin genel bioenergetic sağlığını değerlendirmek için potansiyel olarak yararlı bir tanı aracı olarak bir süre için kabul edilmiştir. Kanser, kardiyovasküler hastalıklar ve mitokondriyal disfonksiyon 1,2 'nörodejeneratif hastalıklar gibi bir dizi hastalıkların atfederek edebiyat yükselen bir vücudu var. Mitokondriyal işlev bozukluğu pro-inflamatuar sinyal yolları teşvik etmek ya da hücre ölümüne yol açan hücresel olaylar bir dizi başlatabilir, bu durum klinik açıdan önemlidir. Pek çok çalışma, fibromiyalji, diyabet, septik şok, ve Alzheimer hastalığı gibi durumlarda 3-7 periferal kan tek-çekirdekli hücreleri ve trombositler mitokondriyal fonksiyonu tanımlanmıştır. Örneğin, yeni bir çalışma, mitokondriyal işlevi için bir işaretleyici olarak, trombositler 'in biyo enerjisini değerlendirildi ve bulunan Tip 2 Diabet gelen trombositleric hastalar mitokondriyal oksijen tüketimi 7,8 azalmıştı. Bu bulgular ve diğerleri, onlar sistemik dolaşıma anket, yerel ve global metabolik değişiklikleri yansıtıyor olabilir beri monositler, lenfositler, nötrofiller, trombositler ve patolojik koşullar altında Bioenerji değişikliklerin vekil belirteçleri hizmet açıktır. Bu yaklaşım prognostik veya tanısal değeri yüksek bir verimlilik analizi yöntemi ve hücre hazırlanması için tutarlı bir yöntem gereklidir olup olmadığını belirlemek için.
Lökosit ve platelet mitokondriyal fonksiyonu ölçmek için yöntemler daha önceleri sağlam hücrelerde 4,9 hücresel biyoenerjitiklerin mitokondri veya değerlendirme izolasyonunu kapsamıştır. Bir hücre dışı akı (XF) analizör kullanılarak cep bioenergetic değerlendirme avantajı hücrelerinde mitokondriyal fonksiyonu, proton kaçak ve maksimal solunum gibi endojen substratların ve solunum parametreleri ile kurulmuş olmasıdırkapasitesi tespit edilebilir. Biz ve diğerleri trombositlerde bioenergetic profiller, insan kanından izole edilen monositler ve lenfositler kurulmuş ve hücre tipleri 8 arasında karşılaştırılabilir olduğunu göstermek için bu teknolojiyi kullanmıştır. Buna ek olarak, hem nötrofiller ve monositler NADPH oksidazlar aktive edildiği bir oksidatif patlama kapasitesine sahip ve süperoksit oluşturulması için oksijen tüketir. Önemlisi, bu yolun doğal bağışıklığın önemli bir bileşenidir ve sistemik inflamasyon ile modüle edilir. Örneğin, oksidatif patlama kapasitesinde değişiklikler, multipl skleroz, artrit, ve tekrarlayan enfeksiyonlar 10,11 gibi çeşitli oto-bağışıklık hastalıkları ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Şu anda klinik örneklerde oksidatif patlama ölçmek için uygun herhangi bir yüksek verimli deneyler, nicel vardır. Nötrofil ve monositlerin oksidatif patlama kapasiteleri karakterize ayrıca çeşitli patolojiler için önemli bir teşhis aracı olarak hizmet edebilir çünkü bu önemlidirara yüzleri.
Anahtar teknik zorluklar, geleneksel polarografik teknikler kullanılarak oksijen tüketiminin ölçülmesi ve daha duyarlı mikroplâka florometrik teknikleri kullanırken bağlı hücreleri kullanmak için ihtiyacı için düşük duyarlılık olmuştur. Bu pratik video, biz bu sorunlara teknik çözüm açıklar. Bu detay monositler, lenfositler, nötrofiller ve monositler ve trombositler ve İnsan kanından nötrofil oksidatif patlama biyoenerjitiklerin izolasyonu, kaplama ve ölçüm için yöntemler. Bu yöntem sahip araştırmacılara biyoenerjitiklerin ve oksidatif patlama, klinik değerlendirme için uygundur bir hasta popülasyonu ve taze kan örnekleri elde etmek için yeteneği erişim.
Bu protokol, biyoenerji analizi için uygun olan bir şekilde kan hücre izolasyonu için çeşitli yaygın olarak kullanılan tekniklerin derleme temsil eder. Sunulan bitişik teknikleri izole edilmiş hücreleri üzerine yerleştirilmiş en az stres ile kontrol edilen ortam koşullarında hücrelerin çok sayıda izole etme kabiliyetleri açısından diğer izolasyon yöntemleri (örneğin, FACs analizi) avantajlıdır. Hatta az kesinti ile uzun izolasyonların dezavantajı vardır. Bu protokol, klinik ve translasyon araştırma içine ekstrapole edilebilir, insan hastalar, birincil kan hücrelerinin izolasyonu için bir temel olarak hizmet vermektedir.
MACS ayırma tam kan ile irtibata hücrelerin izole edilmesi olanağını sunan güvenilir bir hücre izolasyonu bir tekniktir, ancak bu yöntem, antikorun daha fazla miktarda gerektirir ve bu yöntem de tarif edildiği gibi, dört farklı hücre tiplerinin izolasyonu için uygun değildir. B var olaneen bir kanıt aktivasyonuna MACS ayırma sonuçları ile lökositlerin, pozitif seçim eden izolasyon protokol kullanılarak olduğunu göstermek için kullanılır. MACS sütun 50 nm süperparamanyetik parçacıklar konjüge edilmiş antikorlar kullanılarak bir manyetik alan içinde işaretli hücrelerin tecrit edilmesiyle çalışır. Etiketli hücreleri, kolona kapalı elüte edilir. Pozitif ve negatif seçimleri hızlı izolasyon ve saflığı sağlamak için bu protokolü uygulanmaktadır. Vasat hücre sayıları izolasyonu elde edilen veya saflıkta söz konusu olduğunda ise, daha fazla antikor, yüksek saflıkta (Tablo 2) neden olabilir LS kolonu boyunca satıcının talimatları ve ikinci geçit göre numuneye ilave edilebilir. Bizim laboratuvar FACS analizi 8 ile son hücre süspansiyonları analiz ederek, mevcut protokolü kullanarak yüksek saflık ve kaplama verimliliği bulundu.
Ekstrasellüler akı analizörleri ot o zamanla gerçek oksijen tüketimini ve medya asitleştirmenin hem izlemek için yeteneği varonun elektrotlar. DPI 8 ile engellenmesi ile gösterildiği gibi, monositler ve nötrofillerde oksidatif patlama tepki ile görüldüğü gibi, oksijen tüketimi, NADPH oksidaz bağlıdır. Biz uzun süreli izolasyonların veya genişletilmiş XF deneyleri ile oksidatif patlama kapasitesi bir zamana bağlı kaybını gördük. Bu protokol tasarlanmış ve geliştirilmiş XF24 üzerinde kullanım için değil, aynı zamanda, yaklaşık olarak üçte yoğunlukları tohumlama XF24 hücrenin bir yarısı (Şekil 3) XF96 uyumlu edildi.
Bu protokolün tasarımında, her bir teknik için mevcut protokollere bağlılık sadece bioenergetic analizi için ortam koşullarını kontrol için yapılan değişiklikler ile optimum performans için gerekli oldu. Teknikleri mastering sonra, böyle bir protokol, tedavi stratejilerinin toksisite veya etkinliğini ölçmek hastalığı metabolik özelliklerini keşfetmek ve monosit ve neut'ait oksidan üretimi için öteleme ve araştırma uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılabilirenflamatuar koşullarda rophils.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Gloria A Benavides teknik katkısını kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC) tarafından desteklenen, NIDDK Diyabetik Komplikasyonlar Konsorsiyumu (DiaComp, www.diacomp.org) hibe DK076169 (subaward VDU), ve O'Brien Merkezi P30 DK079337 (VDU).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |