혈액 백혈구 및 혈소판은 개인의 생체 에너지 전반적인 건강의 마커로 사용하고 있으므로 병적 과정 및 치료의 효과를 모니터링하기위한 잠재력을 가질 수있다. 여기에서 우리는 미토콘드리아의 기능이 세포의 산화 버스트를 분리하고 측정하는 방법을 설명합니다.
미토콘드리아 장애는 죽상 동맥 경화증, 당뇨병, 패 혈성 쇼크, 및 퇴행성 신경 질환이지만 도전 환자의 생체 에너지 함수의 변화를 평가 같은 병적 조건의 개수에 중요한 역할을하는 것으로 알려져있다. 당뇨병 또는 현재 죽상 동맥 경화증 등의 질환은 임상 적으로 특정 장기의 손상으로 고혈당이나 염증 등의 병리 조직 구성 요소는 백혈구 나 혈소판을 순환에 바이오 에너지 기능을 변경할 수 있지만. 이 개념은 약간의 시간에 대한 인식되었지만 널리 응용 프로그램은 바이오 에너지 분석에 필요한 기본 세포의 많은 수에 의해 제한되어 있습니다. 본 기술 한정 세포 마이크로 플레이트에 활성화하지 않고 부착 될 수 있도록 자성 비드 분리 기술, 세포 접착 기술의 특이성을 조합함으로써 극복되었고, 새로운 기술의 감도가 높은 처리량 MIC 위해 설계roplate respirometry. 이 장비의 예로는 세포 외 유출 분석기입니다. 이러한 장비는 일반적으로 다음 대사에 관련 될 수 자기편 세포에서 이러한 매개 변수의 변화의 속도를 측정하는 산소와 산도에 민감한 프로브를 사용합니다. 여기에 디테일이 인간의 혈액과 이들 세포의 미토콘드리아 생체 에너지 함수의 분석을 활성화하지 않고, 단핵구, 림프구, 호중구와 혈소판의 분리 및 도금 방법을 우리는. 또, 단핵구 및 호중구에서 버스트 산화는 또한 동일한 샘플을 측정 할 수있는 방법을 보여준다. 이 방법은 8-20 ml의 인간의 혈액을 사용하기 때문에 그들은 임상 환경에서 활성 산소 종의 생성 및 생체 에너지를 모니터링하기위한 가능성이있다.
면역 세포 (단핵구, 림프구, 호중구)와 혈액에서 혈소판의 바이오 에너지 상태를 모니터링하는 것은 개인의 전체 바이오 에너지 상태를 평가하기 위해 잠재적으로 유용한 진단 도구로 몇 시간 동안 인정을 받고있다. 암, 심장 혈관 질환과 미토콘드리아 기능 장애 1,2에 신경 퇴행성 질환과 같은 질병의 숫자를 탓 문학의 새로운 몸이있다. 미토콘드리아의 기능 장애는 염증성 신호 전달 경로를 촉진 또는 세포 사망을 초래할 세포 사건의 시리즈를 시작할 수 있기 때문에이 임상 적으로 중요하다. 몇몇 연구는 섬유 근육통, 당뇨병, 패 혈성 쇼크, 그리고 알츠하이머 병 3-7과 같은 조건에있는 말초 혈액 단핵 세포와 혈소판의 미토콘드리아 기능을 특징으로하고 있습니다. 예를 들어, 최근의 연구는 미토콘드리아의 기능을위한 마커로 혈소판의 생체 에너지를 평가하고 발견 2 형 diabet에서 혈소판IC 환자는 미토콘드리아의 산소 소비량을 감소 7,8했다. 이러한 연구 결과와 다른 사람, 그들이 전신 순환을 조사하고 로컬 및 글로벌 신진 대사의 변화를 반영 할 수 있기 때문에 단핵구, 림프구, 호중구, 혈소판은 병적 인 조건에서 생체 에너지의 변화로 대리 마커를 제공 할 수 있음을 알 수있다. 이 방법은 예후 또는 진단 적 가치에게 높은 처리량 분석의 방법과 세포의 준비를위한 일관성있는 방법이 필요가 있는지 여부를 결정합니다.
백혈구 및 혈소판에있는 미토콘드리아의 기능을 측정하는 방법은 이전 그대로 세포 4.9에서 세포 생물 에너지의 미토콘드리아 또는 평가의 분리를 포함하고 있습니다. 세포 외 유출 (XF) 분석을 사용하여 세포 바이오 에너지 평가의 장점은 세포의 미토콘드리아 기능과 같은 양성자 누출 최대한의 호흡과 같은 내생 기판과 호흡 매개 변수를 설정할 수 있다는 것입니다용량이 결정될 수있다. 우리는 다른 사람은 혈소판에있는 바이오 에너지 프로파일은, 인간의 혈액에서 분리 된 단핵 세포와 림프구가 설립 세포 유형 8 사이에서 비교 될 수 있다는 것을 보여주기 위해이 기술을 사용하고 있습니다. 또, 양쪽 호중구 및 단핵 세포가 NAPDH 산화 효소가 활성화되는 산화 적 버스트 용량을 소유하고 과산화물을 형성하는 산소를 소비한다. 중요한 것은,이 통로는 선천성 면역의 핵심 구성 요소이며 조직의 염증에 의해 변조된다. 예를 들어, 산화 적 버스트 용량의 변화가 예컨대 다발성 경화증, 관절염, 재발 성 감염 10,11 등 다양한자가 면역 질환과 관련되어 있음을 보여왔다. 현재 임상 샘플에서 산화 버스트를 측정 할 수 더 높은 처리량 정량 분석이 없습니다. 호중구 및 단핵 세포의 산화 적 버스트 능력을 특성화하는 것도 몇개 patholo위한 중요한 진단 도구로서 작용할 수있다 때문에 이것은 중요GIES.
중요한 기술적 과제는 종래 기술을 사용하여 폴라로그래피 산소 소비량의 측정 및보다 민감한 마이크로 플레이트 형광 기술을 사용하여 세포를 부착 할 때 사용하기위한 필요 최저 감도왔다. 이 실제 비디오에서는, 우리는이 문제에 대한 기술적 솔루션을 설명합니다. 우리는 세부 사항 단핵구, 림프구, 호중구, 혈소판과 단핵구와 인간의 혈액에서 호중구의 산화 버스트의 생체 에너지의 분리, 도금 및 측정을위한 방법.이 방법이 연구자에 대한 생체 에너지와 산화 버스트의 임상 평가에 적합합니다 환자 인구와 신선한 혈액 샘플을 획득 할 수있는 기능에 액세스 할 수 있습니다.
이 프로토콜은 생체 에너지 분석에 적합한 방식으로 혈액 세포 격리위한 여러 일반적 활용 기술의 컴파일을 나타낸다. 제시된 기법은 인접한 고립 셀에 배치 최소 응력으로 제어 된 미디어 조건에서 세포를 다수 분리 할 수있는 능력에 대한 다른 분리 방법 (즉, FACS 분석)에 유리하다. 심지어 최소한의 중단과 긴 아이솔레이션의 단점이있다. 이 프로토콜은 임상 연구 및 병진으로 외삽 될 수 피험자로부터 일차 혈액 세포의 분리를위한 기초로서 역할을한다.
MACS 분리는 전혈에서 직접 세포를 분리 할 가능성을 제공하는 안정적인 세포 격리 기술하고 있지만,이 방법은 항체의 더 많은 양을 필요로하며,이 방법에서 설명한 바와 같이 네 개의 별개의 세포 유형의 분리를위한 최적이 아니다. B가있다EEN 증거는 정품 인증 MACS 분리 결과로 백혈구의 양의 선택은 우리의 격리 프로토콜을 사용하는 것을 보여줍니다 없습니다. MACS 컬럼은 50 nm의 초상 자성 입자에 접합 된 항체를 사용하여 자기장에서 표지화 된 세포의 격리에 의해 기능한다. 표지화 된 세포는 다음 칼럼 오프 용출된다. 긍정적이고 부정적인 선택은 신속한 분리 및 순도를 보장하기 위해이 프로토콜에 구현된다. 불충분 한 세포 수는 격리에서 얻은 순도는 질문에 있다면, 더 많은 항체는 큰 순도 (표 2)가 발생할 수 있습니다 LS의 칼럼을 통해 공급 업체의 지시 및 제 2 통로에 따라 샘플을 추가 할 수 있습니다. 우리 연구소는 FACS 분석 (8)에 의해 최종 세포 현탁액을 분석하여 기존의 프로토콜을 사용하여 고순도 도금 효율을 발견했다.
세포 외 유출 분석기 OT의 위에 실시간으로 산소 소비 및 미디어 산성화를 모두 모니터링 할 수있는 능력을 가지고그녀의 전극. DPI 8 억제에 의해 도시 된 바와 같이 모노 사이트 및 호중구에서 산화 반응에 의해 버스트 관찰 산소 소비는 NADPH 산화 효소 의존적이다. 우리는 장기와 분리되어 또는 확장 XF의 분석과 산화 버스트 용량의 시간 의존 손실을 볼 수있다. 이 프로토콜 설계 및 개발 XF24에서 사용할뿐만 아니라, 약 세 번째 밀도를 뿌리기 XF24 세포의 절반 (그림 3)에 XF96와 호환되었다.
이 프로토콜의 설계에서 각 기술에 대한 기존의 프로토콜 준수는 전적으로 바이오 에너지 분석을위한 미디어의 조건을 제어에 대한 수정과 최적의 성능을 위해 필요했다. 기술을 습득 한 후, 이러한 프로토콜은 치료 전략의 독성 효과를 측정 또는 질환의 대사 특성을 탐구하고, 단핵구 및 neut 의해 산화제 생산 병진 및 연구 다양한 어플리케이션에서 사용될 수있다염증 상태에있는 rophils.
The authors have nothing to disclose.
저자는 글로리아 베 나비 데스의 기술적 공헌을 인정하고 싶습니다. 이 작품은 미국 심장 협회 (American Heart Association) 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC)에 의해 지원되었다, NIDDK 당뇨병 합병증 컨소시엄 (DiaComp, www.diacomp.org) 보조금 DK076169 (subaward의 VDU), 그리고 오브라이언 센터 P30의 DK079337 (VDU).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |