Leucócitos e plaquetas do sangue pode ser usado como um marcador de saúde bioenergética geral de um indivíduo e assim têm potencial para controlar processos patológicos e o impacto de tratamentos. Aqui nós descrevemos um método para isolar e medir a função mitocondrial e do burst oxidativo nestas células.
Disfunção mitocondrial é conhecida por desempenhar um papel significativo num determinado número de condições patológicas tais como a aterosclerose, diabetes, choque séptico, e doenças neurodegenerativas mas avaliar as alterações na função bioenergética em pacientes é um desafio. Embora doenças como a diabetes ou a aterosclerose presente clinicamente com insuficiência órgão específico, os componentes sistêmicos da patologia, tais como hiperglicemia ou inflamação, pode alterar a função bioenergética em leucócitos e plaquetas circulantes. Este conceito tem sido reconhecida por algum tempo, mas a sua aplicação generalizada tem sido limitada pelo grande número de pilhas necessários para a análise bioenergética. Esta limitação técnica tem sido superado combinando a especificidade das técnicas de isolamento do grânulo magnéticas, as técnicas de adesão celular, as quais permitem que as células a serem ligados sem a activação de microplacas, e a sensibilidade de novas tecnologias concebidas para a produção elevada de microfonerespirometria roplate. Um exemplo deste equipamento é o analisador de fluxo extracelular. Tais instrumentos normalmente utiliza sondas sensíveis de oxigênio e pH para medir as taxas de mudança nesses parâmetros em células aderentes, que podem estar relacionados com o metabolismo. Aqui detalhamos os métodos para o isolamento e revestimento de monócitos, linfócitos, neutrófilos e plaquetas, sem ativação, a partir de sangue humano e de análise da função bioenergética mitocondrial nestas células. Além disso, é mostrado como o metabolismo oxidativo em monócitos e neutrófilos também pode ser medido nas mesmas amostras. Uma vez que estes métodos utilizam apenas 8-20 ml de sangue humano que eles têm potencial para monitoramento da geração de espécies reativas de oxigênio e bioenergética em um ambiente clínico.
Monitoramento da saúde bioenergética de células imunes (monócitos, linfócitos, neutrófilos) e plaquetas do sangue tem sido reconhecido por algum tempo como uma ferramenta de diagnóstico potencialmente útil para avaliar a saúde bioenergética geral de um indivíduo. Há um conjunto emergente de literatura atribuindo uma série de doenças como câncer, doenças cardiovasculares e doenças neurodegenerativas para mitocondrial 1,2 disfunção. Isto é clinicamente importante uma vez que a disfunção mitocondrial pode iniciar uma série de eventos celulares que promovem vias de sinalização pró-inflamatórias ou de provocar a morte celular. Vários estudos têm caracterizado função mitocondrial de células mononucleares do sangue periférico e das plaquetas em condições, tais como fibromialgia, diabetes, choque séptico, e doença de Alzheimer 3-7. Por exemplo, um estudo recente avaliou a bioenergética de plaquetas como um marcador para a função mitocondrial e descobriram que as plaquetas de Tipo 2 diabetpacientes ic tinha diminuído 7,8 mitocondrial consumo de oxigênio. A partir desses resultados e outros, é claro que os monócitos, linfócitos, neutrófilos e plaquetas podem servir como marcadores substitutos de mudanças na bioenergética em condições patológicas, uma vez que o levantamento da circulação sistêmica e pode refletir alterações metabólicas locais e globais. Para determinar se esta abordagem tem um método de alto rendimento de análise e é necessário um método consistente para a preparação da célula valor prognóstico ou diagnóstico.
Os métodos para medir a função mitocondrial nos leucócitos e plaquetas já envolveu o isolamento de mitocôndrias ou avaliação da bioenergética celular em células intactas 4,9. A vantagem da avaliação do bioenergética celular utilizando um fluxo extracelular (XF) analisador é que a função mitocondrial em células pode ser estabelecida com os substratos endógenos e os parâmetros respiratórios, tais como vazamento de protões e respiratória máximacapacidade pode ser determinada. Nós e outros autores utilizaram este tecnologia para demonstrar que os perfis de bioenergéticos em plaquetas, monócitos e linfócitos isolados a partir de sangue humano pode ser determinada e comparada entre os vários tipos de células 8. Além disso, ambos os neutrófilos e monócitos possuem uma capacidade de explosão oxidativa em que as oxidases NAPDH são activados e consome oxigénio para formar superóxido. É importante ressaltar que este caminho é um componente chave da imunidade inata e é modulada pela inflamação sistêmica. Por exemplo, tem sido demonstrado que as alterações na capacidade de burst oxidativo está associado a várias doenças auto-imunes, tais como esclerose múltipla, artrite, e as infecções recorrentes 10,11. Actualmente não há alto rendimento ensaios quantitativos disponíveis para medir o burst oxidativo em amostras clínicas. Isso é importante porque a caracterização da capacidade de burst oxidativo de neutrófilos e monócitos também pode servir como uma importante ferramenta de diagnóstico para várias patologiasgias.
Os principais desafios técnicos têm sido baixa sensibilidade para medição do consumo de oxigénio utilizando técnicas polarográficas convencionais e a necessidade de utilizar células ligadas quando utilizando técnicas mais sensíveis de microplacas fluorométricos. Neste vídeo prática, descreve-se a solução técnica para estes problemas. Detalhamos os métodos para o isolamento, chapeamento e medição da bioenergética de monócitos, linfócitos, neutrófilos e plaquetas e burst oxidativo de monócitos e neutrófilos do sangue humano. Este método é adequado para a avaliação clínica da bioenergética e burst oxidativo para os pesquisadores que têm acesso a uma população de pacientes e a capacidade de obtenção de amostras de sangue fresco.
Este protocolo representa a compilação de várias técnicas vulgarmente utilizados para o isolamento de células de sangue de uma forma adequada para análise bioenergética. As técnicas apresentadas contíguas são vantajosos para outros métodos de isolamento (ou seja, a análise FACS) para a sua capacidade para isolar um grande número de células, em condições controladas de comunicação com o mínimo de tensões colocadas sobre as células isoladas. Tem a desvantagem de longos isolamentos, mesmo com o mínimo de interrupções. Este protocolo serve como a base para o isolamento de células sanguíneas primárias a partir de seres humanos, os quais podem ser extrapolados em ambientes clínicos e de investigação translacional.
MACS separação é uma técnica de isolamento de células de confiança, que oferece a possibilidade de isolar as células directamente a partir de sangue total, no entanto, este método requer maiores quantidades de anticorpo e não é óptima para o isolamento de todos os quatro tipos de células diferentes, tal como descrito neste método. Não tem been nenhuma evidência para mostrar que a seleção positiva de leucócitos por MACS a separação resulta em ativação usando o nosso protocolo de isolamento. Colunas MACS funcionar por sequestro de células marcadas em um campo magnético, utilizando anticorpos conjugados com partículas superparamagnéticas 50 nm. As células marcadas são então eluído da coluna. Seleções positivas e negativas são implementadas neste protocolo para garantir o isolamento rápido e pureza. Se o número de células insuficientes são obtidas a partir de isolamento ou a pureza está em questão, mais anticorpos podem ser adicionados à amostra, conforme as instruções do fornecedor e segunda passagem através da coluna LS pode resultar numa maior pureza (Tabela 2). Nosso laboratório encontrado alta pureza e eficiência de plaqueamento utilizando o protocolo existente através da análise de suspensões de células finais pela análise FACS 8.
Analisadores de fluxo extracelulares têm a capacidade de monitorar o consumo de oxigênio ea acidificação mídia em tempo real sobre o de otseus eletrodos. O consumo de oxigênio, como observado pela resposta burst oxidativo em monócitos e neutrófilos é NADPH oxidase dependente como mostrado pela inibição com DPI 8. Vimos uma perda dependente do tempo na capacidade de burst oxidativo com isolamentos prolongados ou ensaios XF estendidos. Este protocolo foi concebido e desenvolvido para utilização na XF24, mas também é compatível com o XF96 em cerca de um terço a metade da célula XF24 semeando densidade (Figura 3).
Na concepção deste protocolo, a adesão aos protocolos existentes para cada técnica foi necessária para o melhor desempenho com as modificações feitas apenas para controlar as condições de mídia para análise bioenergética. Depois de técnicas de dominar, um tal protocolo pode ser utilizado numa vasta gama de aplicações de translação e de pesquisa para medir a toxicidade ou a eficácia de estratégias de tratamento, explorar as características metabólicas da doença e produção de oxidantes por monócitos e neutrophils em condições inflamatórias.
The authors have nothing to disclose.
Os autores gostariam de agradecer a contribuição técnica do Gloria A Benavides. Este trabalho foi financiado pela American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), complicações diabéticas NIDDK Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 concessão (subaward VDU), e o DK079337 P30 O'Brien Center (VDU).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |