Blut-Leukozyten und Blutplättchen können als Marker der Gesamt bioenergetischen Gesundheit einer Person verwendet werden und so das Potenzial haben, pathologische Prozesse und die Auswirkungen der Behandlung zu überwachen. Hier beschreiben wir ein Verfahren zu isolieren und zu messen, die Funktion der Mitochondrien und die oxidative Burst in diesen Zellen.
Mitochondriale Funktionsstörung ist bekannt, eine wichtige Rolle in einer Reihe von pathologischen Zuständen, wie Atherosklerose, Diabetes, septischer Schock, und neurodegenerative Krankheiten, sondern die Beurteilung von Veränderungen in bioenergetischen Funktion bei Patienten ist eine Herausforderung zu spielen. Obwohl Erkrankungen wie Diabetes oder Atherosklerose vorliegenden klinisch bestimmten Organ Beeinträchtigung, die systemischen Komponenten der Pathologie, wie Hyperglykämie oder Entzündung kann bioenergetischen Funktion der zirkulierenden Leukozyten oder Blutplättchen zu verändern. Dieses Konzept hat sich vor einiger Zeit erkannt worden, aber seine weit verbreitete Anwendung ist durch die große Anzahl von Primärzellen für Bioenergetische Analyse benötigt eingeschränkt. Diese technische Einschränkung wurde durch die Kombination der Spezifität der magnetischen Kügelchen Isolationstechniken, Zelladhäsion Techniken, die Zellen ohne Aktivierung zu ermöglichen Mikroplatten befestigt werden überwunden, und die Empfindlichkeit der neuen Technologien für hohen Durchsatz ausgelegt microplate Respirometrie. Ein Beispiel für dieses Gerät ist die extrazelluläre Fluss Analysator. Solche Instrumente verwendet in der Regel Sauerstoff-und pH-empfindliche Sonden an Veränderungsraten in diesen Parametern in adhärenten Zellen, die dann um den Stoffwechsel bezogen werden können, zu messen. Hier werden wir ausführlich die Methoden zur Isolierung und Beschichtung von Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten, ohne Aktivierung, aus menschlichem Blut und der Analyse der mitochondrialen bioenergetischen Funktion in diesen Zellen. Darüber hinaus zeigen wir, wie die oxidative in Monozyten und Neutrophilen-Burst kann auch in den gleichen Proben gemessen werden. Da diese Verfahren nur 8-20 ml menschlichem Blut haben Potential zur Überwachung Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und bioenergetischen in einer klinischen Umgebung.
Überwachen des bioenergetischen Gesundheits von Immunzellen (Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile) und Blutplättchen aus dem Blut ist seit einiger Zeit als ein potentiell nützliches Diagnosewerkzeug, um die Gesamt bioenergetischen Gesundheitszustand einer Person zu beurteilen erkannt. Es ist eine neue Körper der Literatur zuschreibt eine Reihe von Krankheiten wie Krebs, Herz-Kreislauf-Erkrankungen und neurodegenerativen Krankheiten zu mitochondriale Dysfunktion 1,2. Dies ist klinisch wichtig, da die mitochondriale Dysfunktion kann eine Reihe von zellulären Ereignissen, die pro-inflammatorische Signalwege zu fördern oder zu Zelltod einzuleiten. Mehrere Studien haben die mitochondriale Funktion von peripheren mononukleären Blutzellen und Plättchen in Erkrankungen wie Fibromyalgie, Diabetes, septischem Schock, Alzheimer-Krankheit und 3-7 gekennzeichnet. Zum Beispiel eine aktuelle Studie untersuchte die Bioenergetik von Blutplättchen als Marker für die Funktion der Mitochondrien und fand, dass Thrombozyten von Typ-2-Diabetikeric Patienten hatten mitochondriale Sauerstoffverbrauch 7,8 verringert. Aus diesen Erkenntnissen und anderen, ist es klar, dass Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten können als Surrogatmarker der Veränderungen in der Bioenergetik unter pathologischen Bedingungen zu dienen, da sie überblicken den systemischen Kreislauf und können lokale und globale Stoffwechselveränderungen zu reflektieren. Um festzustellen, ob dieser Ansatz hat prognostischen oder diagnostischen Wert eine hohe Durchsatzanalyseverfahren und eine einheitliche Methode für die Zell Vorbereitung erforderlich.
Die Methoden, um die Funktion der Mitochondrien in Leukozyten und Thrombozyten messen zuvor beteiligt Isolierung von Mitochondrien oder Beurteilung der zellulären Bioenergetik in intakten Zellen 4,9. Der Vorteil der zellulären bioenergetischen Bewertung mit einer extrazellulären Fluss (XF)-Analysator ist, dass die Funktion der Mitochondrien in den Zellen mit endogenen Substraten und Atmungsparameter wie Protonenleck und maximale Atmungs eingerichtet werdenKapazität bestimmt werden. Wir und andere haben diese Technik verwendet, um zu zeigen, dass bioenergetische Profile in Thrombozyten, Monozyten und Lymphozyten aus menschlichem Blut isoliert etabliert und kann im Vergleich zu Zelltypen 8 werden. Außerdem sind beide Neutrophilen und Monozyten besitzen einen oxidativen Burst-Eigenschaft, in der NADPH-Oxidasen aktiviert und verbrauchen Sauerstoff in Superoxid. Wichtig ist, dass dieser Weg ein wichtiger Bestandteil der angeborenen Immunität und wird durch systemische Entzündung moduliert. Beispielsweise wurde gezeigt, dass Veränderungen in der oxidativen Burst Kapazität mit verschiedenen Autoimmunerkrankungen wie Multiple Sklerose, Arthritis und wiederkehrenden Infektionen 10,11 verbunden. Derzeit gibt es keine hohen Durchsatz quantitative Tests zur Verfügung, um den oxidativen Burst in klinischen Proben zu messen. Dies ist wichtig, da die Charakterisierung der oxidativen Burst Kapazität von Neutrophilen und Monozyten kann auch als ein wichtiges diagnostisches Werkzeug für mehrere Pathologen dienengien.
Die wichtigsten technischen Herausforderungen wurden geringe Empfindlichkeit für die Messung der Sauerstoffverbrauch mit herkömmlichen Techniken polarographischen und der Notwendigkeit, anhaftenden Zellen verwenden, wenn Sie empfindlicher Mikro fluorimetrischen Techniken. In diesem praktischen Video beschreiben wir die technische Lösung für diese Probleme. Wir detailliert die Methoden zur Isolierung, Beschichtung und Messung der Bioenergetik von Monozyten, Lymphozyten, Neutrophile und Thrombozyten und der oxidativen Burst von Monozyten und Neutrophilen aus menschlichem Blut. Diese Methode eignet sich für die klinische Beurteilung der Bioenergetik und oxidativen Burst für die Ermittler, die haben Zugang zu einer Patientenpopulation und der Fähigkeit, frische Blutproben zu erhalten.
Dieses Protokoll stellt die Zusammenstellung mehrerer häufigsten verwendeten Techniken für die Blutzellisolation in einer für die Analyse der Bioenergetik Weise. Sind die zusammenhängenden Techniken vorgestellt vorteilhaft zu anderen Trennverfahren (zB FACS-Analyse) für ihre Fähigkeit, eine große Anzahl von Zellen in kontrollierten Medien Bedingungen mit minimalen Belastungen auf den isolierten Zellen platziert isolieren. Es hat den Nachteil der langen Isolierungen auch mit minimalen Unterbrechungen. Dieses Protokoll dient als Grundlage für die Isolierung von primären Blutzellen aus menschlichen Probanden, die in klinischen und translationalen Forschung extrapoliert werden kann.
MACS ist eine zuverlässige Trennung Zellisolationsverfahren, das die Möglichkeit zur Isolierung von Zellen direkt aus Vollblut bietet, jedoch erfordert dieses Verfahren größere Mengen an Antikörper und ist nicht optimal für die Trennung aller vier verschiedene Zelltypen, wie in diesem Verfahren beschrieben. Es hat been keine Beweise, um zu zeigen, dass die positive Selektion von Leukozyten durch MACS Trennergebnisse bei der Aktivierung mit unserer Isolation Protokoll. MACS Spalten funktionieren durch Sequestrierung von markierten Zellen in einem Magnetfeld unter Verwendung von Antikörpern zu 50 nm superparamagnetischen Teilchen konjugiert. Markierten Zellen werden dann aus der Säule eluiert. Positive und negative Selektionen werden in diesem Protokoll implementiert, um schnelle Isolierung und Reinheit zu gewährleisten. Wenn nicht genug Zellzahlen werden aus der Isolation erhalten oder Reinheit in Frage, mehr Antikörper kann der Probe nach Anweisung des Herstellers und zweiten Durchgang durch den LS Spalte hinzugefügt werden können, in größerer Reinheit (Tabelle 2) führen. Unser Labor fand hohe Reinheit und Beschichtungseffizienz mit Hilfe der bestehenden Protokolls durch die Analyse von Zellsuspensionen Abschluss durch FACS-Analyse 8.
Extrazelluläre Fluss Analysatoren haben die Möglichkeit, sowohl den Sauerstoffverbrauch und Medien Versauerung in Echtzeit über die der ot überwachenihr Elektroden. Der Sauerstoffverbrauch durch den oxidativen Burst in Monozyten Reaktion und Neutrophile beobachtet NADPH-Oxidase-abhängige wie durch Hemmung mit DPI 8 gezeigt. Wir haben eine zeitabhängige Verlust in oxidativen Burst Kapazität bei längerer oder Isolierungen erweitert XF-Tests gesehen. Dieses Protokoll wurde für die Verwendung im XF24 entworfen und entwickelt, sondern ist auch mit dem XF96 kompatibel zu etwa ein Drittel bis eine Hälfte der Zelle XF24 Einsaatdichten (Abbildung 3).
Im Entwurf des Protokolls wurde die Einhaltung der bestehenden Protokollen für jede Technik für optimale Leistung mit Modifikationen vorgenommen hat, nur um Medienbedingungen für bioenergetische Analyse Kontrolle erforderlich. Nach dem Mastering-Techniken kann ein solches Protokoll in einer breiten Palette von Translations-und Forschungsanwendungen verwendet werden, um die Toxizität und Wirksamkeit von Behandlungsstrategien zu messen, zu erkunden metabolischen Eigenschaften der Krankheit, und Oxidationsmittel-Produktion durch Monozyten-und neut werdenrophils bei Entzündungen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren möchten die technischen Beitrag von Gloria Benavides A bestätigen. Diese Arbeit wurde von der American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC) unterstützt, NIDDK Diabetische Komplikationen Consortium (Diacomp, www.diacomp.org) Zuschuss DK076169 (subaward VDU), und der O'Brien-Center P30 DK079337 (VDU).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |