Лейкоциты крови и тромбоцитов может быть использован в качестве маркера общего биоэнергетического здоровья человека и поэтому имеют потенциал для мониторинга патологических процессов и влияния лечения. Здесь мы опишем метод, чтобы изолировать и измерения функции митохондрий и окислительный взрыв в этих клетках.
Митохондриальной дисфункцией, как известно, играют важную роль во многих патологических состояниях, таких как атеросклероз, диабет, септический шок, и нейродегенеративных заболеваний, но оценки изменений в биоэнергетической функции у больных является сложной задачей. Хотя заболеваний, таких как диабет или атеросклероз настоящего клинически с конкретной нарушений органов, системные компоненты патологии, такие как гипергликемии или воспаления, могут изменить функцию биоэнергетической в циркулирующих лейкоцитов или тромбоцитов. Эта концепция была признана в течение некоторого времени, но его широкое применение сдерживается большим количеством первичных клеток, необходимых для биоэнергетического анализа. Это техническое ограничение было преодолено путем объединения специфику магнитных методов изоляции шарик, методов клеточной адгезии, которые позволяют клеткам быть присоединены без активации в микропланшеты, а чувствительность новых технологий предназначен для высокой пропускной микрофономroplate респирометрии. Примером такого оборудования является внеклеточный анализатор потока. Такая аппаратура, как правило, использует кислород и рН чувствительные датчики для измерения скорости изменения этих параметров в прилипшие клетки, которые затем могут быть связаны с обменом веществ. Здесь мы подробно методы для изоляции и обмуровки моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов, без активации, из крови человека и анализа митохондриальной биоэнергетической функции в этих клетках. Кроме того, показано, как окислительный взрыв в моноцитов и нейтрофилов может быть также измерена в тех же образцах. Так как эти методы используют только 8-20 мл человеческой крови у них есть потенциал для мониторинга поколения и биоэнергетику КИСЛОРОДА в клинических условиях.
Мониторинг биоэнергетический здоровье иммунных клеток (моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов) и тромбоцитов из крови был признан в течение некоторого времени в качестве потенциально полезного диагностического инструмента для оценки общего биоэнергетический здоровье человека. Существует возникающих количество литературы приписывая ряд заболеваний, таких как рак, сердечно-сосудистых заболеваний и нейродегенеративных заболеваний в митохондриальной дисфункции 1,2. Это клинически важно, так как митохондриальная дисфункция может инициировать серию клеточных событий, которые способствуют провоспалительных сигнальных путей или привести к гибели клеток. Несколько исследований характеризуется митохондриальную функцию мононуклеарных клеток периферической крови и тромбоцитов в условиях, таких как фибромиалгии, диабет, септического шока и болезни Альцгеймера 3-7. Например, недавнее исследование оценивали биоэнергетику тромбоцитов в качестве маркера для функции митохондрий и обнаружили, что тромбоциты Тип 2 диабетпациенты IC уменьшилась митохондриальную потребления кислорода 7,8. Исходя из этих данных и других, становится ясно, что моноциты, лимфоциты, нейтрофилы, и тромбоциты могут служить суррогатные маркеры изменений в биоэнергетике при патологических состояниях, так как они обследовать в системный кровоток и может отражать локальные и глобальные метаболические изменения. Чтобы определить, имеет ли такой подход прогностические или диагностическую ценность высокий метод пропускную способность анализа и последовательный метод для клеточного препарата не требуется.
Методы для измерения функции митохондрий в лейкоцитов и тромбоцитов ранее участие изоляцию митохондрий или оценки клеточных биоэнергетики в интактных клетках 4,9. Преимущество сотовой биоэнергетической оценки с использованием внеклеточного поток (XF) анализатора является то, что функции митохондрий в клетках могут быть установлены с эндогенных субстратов и дыхательных параметров, таких как протонного утечки и максимальной дыхательнойЕмкость может быть определена. Мы и другие использовали эту технологию, чтобы показать, что биоэнергетические профили в тромбоцитов, моноцитов и лимфоцитов, выделенных из крови человека может быть установлена и по сравнению среди типов клеток 8. Кроме того, оба нейтрофилы и моноциты обладают способность окислительного пакета, в котором активированный NAPDH оксидазы и поглощают кислород с образованием супероксида. Важно отметить, что этот путь является ключевым компонентом врожденного иммунитета и модулируется системного воспаления. Например, было показано, что изменения в мощности окислительного связаны с различными аутоиммунными заболеваниями, такими как рассеянный склероз, артрит и рецидивирующих инфекций 10,11. В настоящее время нет никаких высокой пропускной количественные анализы доступные для измерения окислительный взрыв в клинических образцах. Это важно, поскольку, характеризующий окислительного потенциала нейтрофилов и моноцитов может также служить в качестве важного диагностического инструмента для нескольких патологичегии.
Ключевые технические проблемы были низкая чувствительность для измерения потребления кислорода с использованием обычных полярографические методы и необходимости использовать присоединенные клетки при использовании более чувствительных методов микропланшет флуорометрические. В этом практическом видео, мы опишем техническое решение этих проблем. Мы подробно методы выделения, обшивки и измерения биоэнергетики моноцитов, лимфоцитов, нейтрофилов и тромбоцитов и окислительного моноцитов и нейтрофилов из крови человека. Этот метод подходит для клинической оценки биоэнергетики и окислительного для следователей, которые имеют доступ к популяции пациентов и возможностью получения свежих образцов крови.
Этот протокол представляет собой компиляцию из нескольких обычно используемых методов для выделения клеток крови в порядке, подходящем для анализа биоэнергетики. Смежные методы, представленные выгодны с другими методами изоляции (т.е. анализа FACS) в отношении их способности изолировать большое число клеток в контролируемых условиях медиа с минимальными напряжениями, размещенных на изолированных клетках. Это имеет тот недостаток, длительных выделений даже с минимальными перерывами. Этот протокол служит основой для выделения первичных клеток крови от человека предметов, которые могут быть экстраполированы в клинических условиях и трансляционных исследований.
Разделение MACS является надежным методом изолятор, что дает возможность изолировать клетки непосредственно из цельной крови, однако этот метод требует больших количеств антител и не является оптимальным для выделения всех четырех различных типов клеток, как описано в этом методе. Там есть бееп нет доказательств, чтобы показать, что положительный выбор лейкоцитов по MACS результатов разделения в активации с помощью нашего протокол изоляции. Колонны MACS функционировать по секвестрации меченых клеток в магнитном поле с помощью антител, конъюгированных с 50 нм суперпарамагнитных частиц. Меченые клетки затем элюируют с колонки. Положительные и отрицательные выборы реализованы в этом протоколе, чтобы обеспечить быстрое выделение и чистоту. Если недостаточное количество клеток получают из изоляции или чистота находится под вопросом, больше антител могут быть добавлены к пробе в соответствии с инструкцией поставщика и второго прохода через колонку LS может привести к большей чистотой (табл. 2). Наша лаборатория обнаружили высокую чистоту и эффективности посева с использованием существующего протокола, анализируя окончательные клеточные суспензии на FACS анализа 8.
Внеклеточные потока анализаторы имеют возможность контролировать как потребление кислорода и окисление СМИ в режиме реального времени по тому из OTее электроды. Потребление кислорода как заметил в ответ окислительный взрыв в моноцитов и нейтрофилов является НАДФН оксидазы зависит, как показано путем ингибирования с ДОИ 8. Мы видели, времени в зависимости потери в окислительной мощности взрыв со длительных выделений или расширенные XF анализов. Этот протокол был разработан и создан для использования на XF24 но также совместим с XF96 примерно от трети до половины ячейки XF24 посева плотности (рис. 3).
В дизайне этого протокола, соблюдение существующих протоколов для каждого метода было необходимо для оптимальной работы с изменений, внесенных исключительно для управления медиа-условия для биоэнергетического анализа. После освоения техники, такой протокол может быть использован в широком спектре поступательных и исследовательских приложений для измерения токсичности или эффективности стратегий лечения, изучить метаболические характеристики болезни, и производство окислитель по моноцитов и NEUTrophils в воспалительных состояний.
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы выразить признательность за техническую вклад Глории A Бенавидес. Эта работа была поддержана Американская Ассоциация Сердца 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (ПАК), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), NIDDK диабетических осложнений консорциум (DiaComp, www.diacomp.org) грант DK076169 (subaward ВДУ), и P30 DK079337 О'Брайен центр (ВДУ).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |