leucocytes du sang et de plaquettes peuvent être utilisé comme un marqueur de la santé bioénergétique globale d'un individu et ainsi avoir la possibilité de surveiller les processus pathologiques et l'impact des traitements. Nous décrivons ici un procédé pour isoler et mesurer la fonction mitochondriale et de la poussée oxydative dans ces cellules.
Dysfonctionnement mitochondrial est connue pour jouer un rôle important dans un certain nombre de conditions pathologiques telles que l'athérosclérose, le diabète, le choc septique, et les maladies neurodégénératives, mais l'évaluation des changements dans la fonction bioénergétique chez les patients est un défi. Bien que les maladies telles que le diabète ou l'athérosclérose présente cliniquement atteints d'insuffisance d'organe spécifique, les composantes systémiques de la pathologie, tels que l'hyperglycémie ou l'inflammation, peuvent altérer la fonction bioénergétique dans les leucocytes ou les plaquettes de circulation. Ce concept a été reconnu depuis un certain temps, mais son application généralisée a été entravée par le grand nombre de cellules primaires nécessaires à l'analyse bioénergétique. Cette limitation technique a été résolu par la combinaison de la spécificité des techniques d'isolement de billes magnétiques, des techniques d'adhérence cellulaire, qui permettent aux cellules d'être fixés sans activation de microplaques, et la sensibilité des nouvelles technologies conçue pour un débit élevé micrespirométrie ROPLATE. Un exemple de cet appareil est un analyseur de flux extracellulaire. Cette instrumentation utilise généralement l'oxygène et le pH sondes sensibles pour mesurer les taux de variation de ces paramètres dans les cellules adhérentes, qui peuvent ensuite être liés au métabolisme. Ici, nous détaillons les méthodes d'isolement et de placage de monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes, sans activation, à partir de sang humain et de l'analyse de la fonction mitochondriale bioénergétique dans ces cellules. En outre, nous montrons comment la poussée oxydative dans les monocytes et les neutrophiles peut aussi être mesurée dans les mêmes échantillons. Puisque ces méthodes utilisent seulement 8-20 ml de sang humain, ils ont le potentiel pour le suivi réactif génération et la bioénergétique des espèces d'oxygène dans un cadre clinique.
Surveillance de la santé métabolique de cellules immunitaires (monocytes, lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes) du sang a été reconnu depuis un certain temps comme un outil de diagnostic potentiellement utile pour évaluer la santé bioénergétique globale d'un individu. Il existe un corps émergeant de la littérature attribuer un certain nombre de maladies telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives à un dysfonctionnement mitochondrial 1,2. Ceci est d'importance clinique depuis un dysfonctionnement mitochondrial peut initier une série d'événements cellulaires qui favorisent les voies de signalisation pro-inflammatoires, ou conduisent à la mort cellulaire. Plusieurs études ont caractérisé la fonction mitochondriale des cellules et les plaquettes sanguines mononucléaires périphériques dans des conditions telles que la fibromyalgie, le diabète, un choc septique, et la maladie d'Alzheimer 7.3. Par exemple, une étude récente a évalué les bioénergétique des plaquettes comme un marqueur de la fonction mitochondriale et a constaté que les plaquettes de type 2 diabetic patients avaient diminué la consommation d'oxygène des mitochondries 7,8. A partir de ces conclusions et d'autres, il est clair que les monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes peuvent servir de marqueurs de substitution de l'évolution de la bioénergétique dans des conditions pathologiques puisqu'ils enquête la circulation systémique et peuvent refléter des changements métaboliques locaux et mondiaux. Pour déterminer si cette approche a une valeur pronostique ou diagnostique une méthode à haut débit d'analyse et une méthode cohérente pour la préparation de cellules est nécessaire.
Les méthodes pour mesurer la fonction mitochondriale dans les leucocytes et les plaquettes ont déjà participé isolement des mitochondries ou l'évaluation de bioénergétique cellulaire dans des cellules intactes 4,9. L'avantage de l'évaluation bioénergétique cellulaire en utilisant un flux extracellulaire (XF) d'analyseur est que la fonction mitochondriale dans les cellules peut être établie avec des substrats endogènes et des paramètres respiratoires tels que fuite de protons et respiratoire maximalecapacité peut être déterminée. Nous et d'autres avons utilisé cette technologie pour montrer que les profils bioénergétiques dans les plaquettes, les monocytes et les lymphocytes isolés à partir de sang humain peuvent être établis et comparés entre les différents types de cellules 8. En outre, deux des neutrophiles et des monocytes possèdent une capacité oxydative dans laquelle oxydases NADPH sont activés et consomment de l'oxygène pour former la superoxyde. Surtout, cette voie est un élément clé de l'immunité innée et est modulée par l'inflammation systémique. Par exemple, il a été montré que les variations de la capacité oxydante de salve sont associés à diverses maladies auto-immunes telles que la sclérose en plaques, l'arthrite, et des infections récurrentes 10,11. Actuellement, il n'y a pas de tests quantitatifs à haut débit disponibles pour mesurer la poussée oxydative dans des échantillons cliniques. Ceci est important étant donné que la caractérisation de la capacité oxydative des neutrophiles et des monocytes peut également servir d'outil de diagnostic important pour plusieurs pathologies.
Les principaux défis techniques ont été peu sensible pour la mesure de la consommation d'oxygène en utilisant des techniques polarographiques classiques et la nécessité d'utiliser des cellules fixées lors de l'utilisation des techniques de microplaque fluorométriques plus sensibles. Dans cette vidéo pratique, nous décrivons la solution à ces problèmes techniques. Nous détaillons les méthodes pour l'isolement, le placage et la mesure de la bioénergétique de monocytes, les lymphocytes, les neutrophiles et les plaquettes et la poussée oxydative des monocytes et des neutrophiles du sang humain. Cette méthode est appropriée pour l'évaluation clinique de la bioénergétique et oxydatif pour les enquêteurs qui ont l'accès à une population de patients, et la capacité d'obtenir des échantillons de sang frais.
Ce protocole représente la compilation de plusieurs techniques couramment utilisées pour l'isolement de cellules de sang, d'une manière adaptée à l'analyse de la bioénergétique. Les techniques présentées contigus sont avantageux à d'autres méthodes d'isolement (analyse FACS) pour leur capacité à isoler un grand nombre de cellules dans des conditions contrôlées de médias avec un minimum de contraintes placées sur des cellules isolées. Il présente l'inconvénient de longs isolements même avec un minimum d'interruptions. Ce protocole sert de base pour l'isolement de cellules du sang de sujets humains primaires, qui peuvent être extrapolés à des paramètres cliniques et de recherche de translation.
MACS séparation est une technique d'isolement des cellules fiable qui offre la possibilité d'isoler les cellules directement à partir du sang total, mais ce procédé nécessite de plus grandes quantités d'anticorps et n'est pas optimale pour l'isolement de l'ensemble des quatre types distincts de cellules telles que décrites dans la présente méthode. Il a been aucune preuve pour montrer que la sélection positive des leucocytes par les résultats de séparation MACS dans l'activation en utilisant notre protocole d'isolement. Colonnes MACS fonctionnent par la séquestration de cellules marquées dans un champ magnétique en utilisant des anticorps conjugués à des particules superparamagnétiques 50 nm. Les cellules marquées sont ensuite élues de la colonne. Sélections positives et négatives sont mises en œuvre dans ce protocole afin d'assurer l'isolement rapide et la pureté. Si le nombre de cellules sont obtenues à partir de l'insuffisance isolement ou la pureté en question est, plusieurs anticorps peuvent être ajoutés à l'échantillon selon les instructions du fournisseur et le second passage à travers la colonne de LS peut se traduire par une plus grande pureté (tableau 2). Notre laboratoire a trouvé une grande pureté et l'efficacité de placage à l'aide du protocole existant en analysant suspensions cellulaires finales par analyse FACS 8.
Analyseurs de flux extracellulaires ont la possibilité de surveiller à la fois la consommation d'oxygène et l'acidification des médias en temps réel sur celle de otses électrodes. La consommation d'oxygène telle qu'elle est observée par la réaction oxydative dans les monocytes et les neutrophiles est la NADPH oxydase dépendante comme indiqué par l'inhibition avec le DPI 8. Nous avons constaté une perte dépendant du temps de la capacité de salve oxydative avec isolements prolongés ou des dosages de XF étendues. Ce protocole a été conçu et mis au point pour une utilisation sur le XF24 mais est également compatible avec le XF96 à environ un tiers à une moitié de la cellule XF24 densités d'ensemencement (Figure 3).
Dans la conception de ce protocole, l'adhésion aux protocoles existants pour chaque technique était nécessaire pour des performances optimales avec des modifications apportées uniquement à contrôler les conditions de médias pour l'analyse bioénergétique. Après la maîtrise des techniques, un tel protocole peut être utilisé dans un large éventail d'applications de translation et de recherche pour mesurer la toxicité ou l'efficacité des stratégies de traitement, d'explorer les caractéristiques métaboliques de la maladie, et la production d'oxydants par des monocytes et neutrophils dans des conditions inflammatoires.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à souligner la contribution technique de Gloria Benavides A. Ce travail a été soutenu par l'American Heart Association 13PRE16390001 (SR), NIH T32HL07918 (PAK), NIH T32HL007457 (TM), P30DK056336 (BKC), les complications diabétiques NIDDK Consortium (DiaComp, www.diacomp.org) DK076169 de subvention (sous-subvention sur écran), et le P30 DK079337 O'Brien Center (sur écran).
QuadroMACS Starting Kit incl. QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-094-833 | |
CD235a (Glycophorin A) MicroBeads, human | Miltenyi Biotec | 130-050-501 | |
CD61 MicroBeads, human for platelets | Miltenyi Biotec | 130-051-101 | |
CD14 MicroBeads, human for monocytes | Miltenyi Biotec | 130-050-201 | |
CD15 MicroBeads, human for granulocytes | Miltenyi Biotec | 130-046-601 | |
LS Columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
BD Vacutainer ACD Blood collection tubes | Fisher | 02-684-26 | |
RPMI 1640 | Gibco | 11835-030 | with L-glutamine and without phenol red |
Prostaglandin I2, sodium salt | Cayman | 18220 | |
1.5 ml semi-micro cuvettes | Phenix Research Products | SC-2410 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.077 | Sigma | 10771 | |
Histopaque density gradient, specific gravity 1.119 | Sigma | 11191 | |
Bovine Serum Albumin Fraction V | Roche | 3117405001 | fatty-acid ultra-free |
Phorbol 12-myristate 13-acetate | Sigma | P8139 | |
XF24 FluxPak | Seahorse Biosciences | 100850-001 | |
DMEM | Fisher | MT90113PB | w/o Glucose, L-Glutamine, Pyruvate, Phenol Red, and Bicarbonate |
L-Glutamine, 200mM (100x) | Invitrogen | 25030-081 | |
D-Glucose | Sigma | G7528 | |
Sodium Pyruvate | Sigma | P8574 | |
Cell-Tak (cell adhesive) | BD Biosciences | CB-40242 | |
Oligomycin | Sigma | O4876 | |
Antimycin A | Sigma | A8674 | |
(FCCP) Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Sigma | C-2920 | |
DC Protein Assay Reagent A | Bio-Rad | 500-0113 | |
DC Protein Assay Reagent S | Bio-Rad | 500-0015 | |
DC Protein Assay Reagent B | Bio-Rad | 500-0114 | |
Equipment | Vendor | Product # | Comments/Description |
Seahorse | Seahorse Biosciences | ||
QuadroMACS Separator and MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-090-976 and 24039 | |
Spectrophotometer |