Kuvvet ölçümleri geliştirme, yaralanma, hastalık, tedavi ya da kimyasal toksisite nedeniyle kas fonksiyonu değişiklikleri göstermek için kullanılabilir. Bu video, Zebra balığı larva gövde kas bir maksimal kasılma sırasında güç ölçmek için bir yöntem ortaya koymaktadır.
Zebra balığı larvaları kas gelişimi, kas hastalığı ve kas ile ilgili kimyasal toksisite modeller sunmak, ancak ilgili çalışmalar genellikle kas sağlık işlevsel önlemler eksikliği. Bu video makalede, biz Zebra balığı larva gövde kas kasılması sırasında kuvvet oluşturma ölçmek için bir yöntem ortaya koymaktadır. Kuvvet ölçümleri, bir tuz çözeltisi ile doldurulmuş bir bölme içine bir anestezi larva yerleştirerek gerçekleştirilir. Larva ön sonunda bir güç dönüştürücü bağlıdır ve larva arka sonunda uzunluğu kontrol bağlıdır. Izometrik bir seğirme kasılma elektrik alanı stimülasyonu tarafından ortaya çıkarılan ve kuvvet tepki analizi için kaydedilir. Kasılma sırasında kuvvet oluşturma genel kas sağlık bir ölçü sağlar ve özellikle kas fonksiyonu bir ölçü sağlar. , Vahşi-tip larva ile kullanılmak için bu tekniğin tarif rağmen, bu yöntem, genetik olarak değiştirilmiş larvaları ile uyuşturucu ya da toksik maddeler ile tedavi larvaları ile kullanılabilirkas hastalık modelleri karakterize ve tedavileri değerlendirmek, ya da kas gelişimi, yaralanma veya kimyasal toksisite çalışma için.
Genç Zebra balığı (Br.rerio) larvaları, 3-7 gün sonrası fertilizasyon (DPF), giderek iskelet kas araştırmalar için yararlı bir organizma olarak kabul edilmektedir. Genç larva modeli insan kas hastalığı 1-9 için kullanılır, ilaç ve tedavi stratejileri 10-11, çalışma kas yaralanması 12 değerlendirmek gelişimi 13-16 kas anlamak ve kas ile ilgili kimyasal toksisite 17-19 araştırmak. Bu alanlarda tipik çalışmalar sağlıklı kas genetik manipülasyon veya toksik maruz anormal hale olduğu derecesini incelemek ve bazı çalışmalar anormal kas tedaviye yanıt verir derecesi inceleyin. Bu çalışmaların başarısı için kritik doğru kas sağlığını değerlendirmek için yeteneğidir.
Zebra balığı larvaları kas sağlığını değerlendirmek için mevcut çeşitli yöntemler olmakla birlikte, birkaç kas fonksiyonu hakkında doğrudan bilgi sağlar. Kas sağlık genellikle appearanc tarafından değerlendirilirolarak 9,15,16,18 immün histolojik boyama 6,8,11,, ışık mikroskobu 3,13, elektron mikroskobu 3,4,14,16 veya çift kırılma 7,9,11 ile değerlendirilen e,, ancak bu teknikleri sağlamak morfolojik bilgiler sadece. Gövde ve kuyruk değiştirmeler ve hız 4,17 motor fonksiyon değerlendirmek, ama onlar da nöral giriş, enerji metabolizması, ve diğer işlemler yansıtan bu yana bu kas fonksiyonlarının doğrudan tedbirler değildir yüzme.
Buna karşılık, kasılma sırasında kuvvet oluşturma ölçüm kas fonksiyonu doğrudan bir değerlendirme sağlar ve genel kas sağlık iyi bir göstergesidir. Bu yaklaşımın da yarar basit veri analizi ve kantitatif sonuçlarını içerir. Bu video makalede, daha araştırmacı araştırmalarında kas sağlık mevcut önlemleri tamamlamak için bu yöntemi kullanacağı umuduyla, larva kaslar tarafından kuvvet oluşturma ölçmek için ayrıntılı bir prosedür sağlar.
<pclass = "jove_content"> Bu yöntemin genel amacı Zebra balığı larva gövde kas kasılması sırasında kuvvet oluşturma ölçmektir. Bu amacı gerçekleştirmek için, bir Zebra balığı larva anestezi ve bir tuz çözeltisi ile dolu bir odasına yerleştirilir. Larva ön sonunda bir güç dönüştürücü bağlıdır ve larva arka sonunda uzunluğu kontrol bağlıdır. Kas aktivasyonu elektrik alanı stimülasyonu ile gerçekleştirilir, ve uyarım akımı ve larva uzunluğu maksimum seğirme kuvveti üretmek için ayarlanır. Izometrik bir seğirme kasılma ortaya çıkardı ve kuvvet tepki analizi için kaydedilir.Açık olmak gerekirse, bu teknik yüzme sırasında larva kasları tarafından oluşturulan kuvvetlerin ölçmez. Larva her iki ucunda ekipman bağlı ve larva anestezi kaldığından, bu test sırasında hareket başlatmak çünkü. Dahası, alan uyarımı bir bil sebep olmak için aynı anda tüm kas lifleri aktivedoğal olarak 20 ne olacağı değil ateral daralma,. Bu nedenle, daha çok yüzme sırasında oluşturulan gerçek kuvvetlerinin ölçülmesi yerine, bu teknik larva kaslarının kuvvetini üreten yeteneği belirler.
Biz kas nemaline miyopati 21 bir Zebra balığı modelinde zayıflık, hem de çok MiniCore hastalığı 22 bir Zebra balığı modelinde kas fonksiyonu üzerine antioksidan tedavinin etkisini değerlendirmek için göstermek için bu tekniği kullandık. Diğer kas fonksiyonu 19 bir çevre kirletici etkilerini incelemek için benzer bir teknik 23 kullandık.
Bu yöntem, Zebra balığı larvalarının gövde kaslarının kas fonksiyonunu değerlendirmek için bir seğirme sırasında kuvvet oluşturma ölçer. Tetanik kasılmaları (0.2 sn bir süre için 200 stimülasyon darbe / sn gibi) Zebra balığı larvaları ortaya çıkardı olmasına rağmen, en fazla tetanik gücü maksimum seğirme gücü göre sadece% 10-15 daha fazladır. Bu nedenle, bir seğirme sırasında üretilen kuvvet kuvvet üreten özelliği makul bir ölçüsüdür. Tiki programı ya da dikiş bağları da kayma neden daha az olasıdır çünkü seyirmesi tetanik kasılmaları tercih edilir.
Bu teknik ile anlamlı veriler elde etmek için, en seğirme kuvvet her bir larva için elde edilmelidir ve deney grupları arasında değişkenliği en aza indirilmelidir. Akılda bu hedefleri ile, aşağıdaki önerileri sunuyoruz. Kuvvet dönüştürücü ve uzunluğu kontrol tüplerine larva bağlama zaman önce, dikkat edin. Dikiş döngüler çok sıkılırsaçok, dikiş kas dokusu ile kesecek. Dikiş döngüler yeterince sıkılır değilseniz, larva tarafından üretilen kuvvet tam kuvvet dönüştürücü iletilir olmayacaktır. Her iki durum da, ama özellikle ikinci, maksimum seğirme gücü hafife. Larva test döneminde geliştirmeye devam edecektir çünkü İkincisi, birden fazla deney grupları test yana gruplar arasında alternatif birkaç saat (20-30 dk / larva), alabilir.
Bahsedilen ürün, bazı maksimum seğirme kuvveti ölçümü (örneğin güç dönüştürücü, akımlı uyarıcı) için gerekli olsa da, diğer öğeleri mutlaka gerekli değildir. Video sarkomer boyu sistemi arzu ancak gerekli değildir. Bir alternatif olarak, tikler bir dizi maksimum seğirme kuvveti elde edilene kadar larva uzunluğu ayarlanır sırasında optimal uzunlukta, bulmak için de kullanılabilir. Bir sıcaklık kontrol sistemi de zorunlu olarak gerekli değildir. Sıcaklık kontrolü zaman mea önemlidirmaksimum kuvvet seğirme az miktarda sıcaklık değişimlerine özellikle hassas değildir ve oda sıcaklığında ölçülen olabilir, oysa sıcaklığına kadar son derece duyarlı olan bilyenin seğirme kinetiği. Bağımsız olarak kuvvet test sırasında odasının sıcaklığı arasında, larvaların ° C'de 24 önceden zorlamaya 28.5 arasında optimum büyüme sıcaklıkta muhafaza edilmesi gerektiğine dikkat ediniz doğru evreleme için test.
Larvalar tricaine içeren Tyrodes çözeltisi içinde test edilmiştir. Bu sinir sistemi tarafından uyarılan kasılmaları kendiliğinden ortadan kaldırmak ve böylece kuvvet test sırasında yorgunluğu önlemek için (w / v) tricaine, anestezi 24 için tavsiye edilen konsantrasyonu,% 0.02 kullanın. Tricaine de tie-adım kolaylaştırır ve genel test süresini azaltır. Bununla birlikte, test çözeltisi tricaine dahil olmak üzere sürekli olarak yaklaşık% 30 ile en fazla seğirme gücünü azalttığı görüyoruz. Benzer bir etki, aynı zamanda tricai burada, tetra kuyruk kas gözlenmiştirnöromüsküler iletim bloke sonra ne tricaine kas 25 üzerinde doğrudan etkisi olduğunu düşündüren, kuvvet oluşturma azalır. Bu sinir hücreleri 26'da olduğu gibi Tricaine, hücre zarından sodyum iletkenlik azaltarak kas hücre uyarılabilirliğinin azaltabilir. Motor nöronlar tarafından aktivasyonu bloke edilmesi için diğer seçenekler D-tübokurarin ve α-bungarotoxin ancak, tricaine farklı olarak, bu bileşikler, deri geçirgen değildir ve kafa, omurilik, kalp ya da 27 içine doğrudan enjekte edilmesi gerekir. Bireysel araştırmacılar tricaine kendi özel uygulama için arzu edilir olup olmadığını değerlendirmek gerekir. Tricaine test çözümü dahil edilirse tricaine etkisini deney grupları arasında farklılık olmadığını doğrulamanız gerekir, konsantrasyon deneyler ve araştırmacılar arasında tutarlı olmalıdır.
Biz 3 dpf'e gibi genç ve 7 dpf kadar eski olarak larva için bu yöntem açıklanmaktadır. Kas lifleri fu gibi görünse de3 dpf'e test ekipmanları için larva bağlama engelleyen önce kendiliğinden kuyruk hareketleri 27, kuyruk kısa boy başlar 17 saat sonrası döllenme, gibi erken nctional. Birçok hastalık modelleri bu kez çok daha uzun hayatta olmadığı için biz genellikle 7 dpf'e sonra larva testi yok. 5 dpf ötesinde larva test durumunda, larvaların beslenmelidir. Biz beslenmemiş larva olasılıkla beslenen larvalar, azalan yolk kesesi nedeniyle daha küçük kasları ve daha az maksimum seğirme güç üreten gözlemledim. Bu nedenle, dış besleme ek değişken önlemek için, 3-5 dpf arasındaki larvaları test etmek için arzu edilebilir.
Özet olarak, Zebra balığı larva gövde kas maksimal seğirme kasılma sırasında kuvvet oluşturma ölçmek için bir nicel ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, Zebra balığı larva kas genel sağlık değerlendirmek için kullanılan ve özellikle kas fonksiyonu hakkında bilgi sağlar edilebilir. Hakkında bilgi vermenin yanı sırakuvvet kuşak büyüklüğü, bu teknik, kuvvet kuşak kinetiğini incelemek için 22 ya da kas yorgunluğu çalışmaya adapte edilebilir kullanılabilir. , Vahşi-tip larva ile kullanılmak için bu tekniğin tarif olmasına rağmen, bu yöntem, kas hastalık modelleri karakterize eden ve tedavilerini ya da kas gelişimi, kas yaralanma veya çalışma için, genetik olarak modifiye edilmiş ya da larvalar için ilaçlar veya toksik maddeler ile tedavi edilen larvalar için kullanılabilir kas ile ilgili kimyasal toksisite.
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Zebra balığı yetiştiriciliği ile yardım için Angela Busta teşekkür ederim. Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (AG-020.591 için SVB ve JJD için 1K08AR054835) tarafından desteklenmiştir.
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |