力的测量可以用来演示肌肉功能的变化,由于开发,损伤,疾病,治疗或化学毒性。在这段视频中,我们展示了一个方法来测量期间最大的斑马鱼幼体躯干肌肉收缩力。
斑马鱼幼虫提供模型,肌肉发达,肌肉疾病和肌肉相关的化学毒性,但相关的研究往往缺乏功能性的措施肌肉健康。在这个视频文章中,我们展示了在斑马鱼幼体躯干肌肉收缩力产生的方法来衡量。力的测量是通过将麻醉幼虫与盐溶液填充到腔室中。幼虫的前端绑绑力传感器和幼虫的后端的长度控制器。的等距抽搐收缩引起的电场刺激力响应的记录,可进行分析。强制收缩过程中产生提供了一个衡量的整体肌肉的健康,并特别提供了一个衡量的肌肉功能。虽然,我们描述这种技术用于与野生型幼虫,此方法可用于转基因的幼虫或治疗的药物或毒物的幼虫,表征肌肉疾病模型,并评估治疗,或研究肌肉的发育,损伤或化学毒性。
年轻的斑马鱼( 斑马鱼 )幼虫3-7天受精后(DPF),正日益被视为一个有用的生物骨骼肌研究。年轻的幼虫是用来模型人体肌肉疾病1-9,评估药物和治疗策略10-11,研究肌肉损伤12,了解肌肉发展13-16,调查肌肉相关化学毒性17-19。在这些领域的典型研究探讨在何种程度上呈现健康的肌肉异常的遗传操作或接触毒物,和一些研究肌肉异常的程度,对治疗的反应。这些研究的成功的关键是能够准确评估肌肉健康。
虽然有多种方法可用来评估在斑马鱼幼虫的肌肉健康,很少有肌肉功能提供了直接的信息。通常由appearanc评估肌肉健康E,组织学染色6,8,11,免疫组化9,15,16,18光显微镜3,13,电子显微镜3,4,14,16或双折射7,9,11评估,但是这些技术提供形态学信息。躯干和尾的位移和游泳速度4,17评估运动功能,但这些都不是肌肉功能的直接措施,因为它们也反映了神经元的输入,能量代谢,和其他进程。
相比之下,测量力产生收缩时,肌肉功能的评估提供了一个直接代表一个衡量整体肌肉健康。添加这种方法的好处包括简单的数据分析与定量结果。在这个视频文章中,我们提供了测力代幼虫的肌肉,希望更多的研究人员将使用这种方法来补充现有措施的肌肉的健康,在他们的研究中的详细步骤。
<p类=“jove_content”>这种方法的总体目标是测量在斑马鱼幼体躯干肌肉收缩力产生。为了实现这个目标,是斑马鱼幼虫麻醉并置于一个腔室填充有盐溶液。幼虫的前端绑绑力传感器和幼虫的后端的长度控制器。肌肉活化是通过电场刺激,刺激电流和幼虫的长度调整,以产生最大抽搐力。引起的等距抽搐收缩力响应的记录,可进行分析。要清楚,这种技术不测量幼虫的肌肉在游泳过程中所产生的力量。由于幼虫两端被连接到设备,因为幼虫保持麻醉,不能启动在测试过程中的运动。此外,电场刺激激活所有的肌纤维在同一时间,以诱导亿抵押品的收缩,而这并不是自然发生20。因此,而不是测量游泳过程中产生的实际力量,这种技术决定幼虫肌肉的力量发电能力。
我们已经使用这种技术来证明肌肉无力的杆状体肌病21斑马鱼的模型,以及多的MiniCore疾病22在斑马鱼模型来评价对肌肉功能的抗氧化处理的效果。其他已经使用了类似的技术23检查19对肌肉功能的一种环境污染物的影响。
这种方法测量力产生评估肌肉功能的斑马鱼幼虫的躯干肌肉在抽搐。虽然强直收缩,可引起斑马鱼幼虫( 如 200个刺激脉冲/秒的持续时间为0.2秒),最大强直收缩力大于最大抽搐力只有10-15%。因此,抽动过程中产生的力力发电能力是一个合理的措施。抽搐优于强直收缩,因为抽搐是不太可能导致抓取或打滑缝线处的关系。
为了产生有意义的数据,使用这种技术,最大抽搐力应达到每幼虫,应尽量减少和实验组之间的可变性。考虑到这些目标,我们提出以下建议。首先,照顾绑幼虫时,力传感器和控制器管长度。 ,如果缝合回路拧得过紧多,缝合肌肉组织将通过削减。如果没有足够的拧紧的缝合线回路,幼虫产生的力将不会被完全传递力传感器。这两种情况下,尤其是后者,低估抽搐力最大。其次,由于多个实验组的测试,可能需要几个小时(20-30分钟/幼虫),群体之间的交替,因为幼虫测试期间将继续发展。
虽然有些人提到的设备是必不可少的测量最大抽搐力( 如力传感器,电流刺激),其他物品都是绝对必要的。视频肌节长度系统是可取的,但不是必需的。作为替代方案,可用于一系列抽搐来找到最优的长度,在此期间,幼虫的长度进行调整,直到达到最大抽搐力。一个温度控制系统也并非绝对必要。测量时,温度控制是关键一定抽搐动力学,这是对温度高度敏感,而最大抽搐力不是特别敏感温度的微小变化,并且可以在室温下测量。请注意,无论力试验过程中的腔室中的温度,幼虫应保持在最佳生长温度为28.5°C 24前力测试准确分期。
幼虫的Tyrodes解决方案,其中包含三卡因在测试。我们用0.02%(W / V)三卡因,建议麻醉24的浓度,以消除由神经系统诱发的自发性收缩,从而防止疲劳力测试期间。三卡因也促进了系上的步骤,并降低了整体测试时间。然而,我们观察到,包括在测试溶液中的三卡因持续时间约30%的最大抽搐力。蝌蚪的尾巴肌肉也观察到类似的效果,其中tricai东北力一代又降低神经肌肉的传导受阻,这表明三卡因25肌肉有直接的影响。三卡因可减少通过减少钠离子传导穿过细胞膜,肌细胞的兴奋性,因为它在神经细胞26。阻止运动神经元的激活的其他可供选择的是 d-筒箭毒碱和α-银环蛇毒素,但不像三卡因,这些化合物不透皮肤,必须直接注射到头部,脊髓,或心脏27。个别研究者将需要评估是否三卡因是可取其具体应用。如果三卡因被包括在测试溶液中的浓度应该是一致的实验和研究人员之间应验证,三卡因的效果实验组之间不发生变化。
我们描述了这种方法,3 DPF和年轻的老7 DPF幼虫。虽然肌纤维出现富nctional早在受精后17小时,自发尾巴运动开始时,27日 ,短尾巴的长度,前3 DPF阻碍把幼虫的检测设备。我们通常不测试后7日龄幼虫,因为许多疾病模型不生存更长的时间超过这个时间。测试5 DPF幼虫超越,如果要喂幼虫。我们观察到,不喂食幼虫有较小的肌肉和生成较少的最大抽动力比喂养幼虫,可能是由于减少卵黄囊。因此,它可能是可取的测试3-5单丝旦数之间的幼虫,避免了额外的外部馈送的变量。
综上所述,我们描述了一个定量的,可靠的方法测量期间最大的斑马鱼幼体躯干肌肉抽搐收缩力产生。这种方法可以用来评估整体健康的斑马鱼幼虫的肌肉,并明确规定有关肌肉功能。除了提供有关力产生的大小,这种技术可以用于研究动力学的力的产生,或适用于研究肌肉疲劳22。虽然我们描述这种技术用于与野生型幼虫,此方法可用于转基因的幼虫或治疗用药物或毒物的幼虫,表征肌肉疾病模型和评价治疗或研究肌肉的发育,肌肉损伤,或肌肉相关的化学毒性。
The authors have nothing to disclose.
作者感谢安吉拉·布斯塔与斑马鱼养殖的援助。这项工作是由美国国立卫生研究院(AG-020591 SVB和1K08AR054835 JJD),支持。
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |