mesures de force peuvent être utilisés pour démontrer les changements de la fonction musculaire en raison du développement, les blessures, la maladie, le traitement ou la toxicité chimique. Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode pour mesurer la force lors d'une contraction maximale du poisson zèbre muscles du tronc larvaire.
Les larves de poisson zèbre fournir des modèles de développement musculaire, maladie du muscle et le muscle lié toxicité chimique, mais des études liées manquent souvent de mesures fonctionnelles de la santé des muscles. Dans cet article, vidéo, nous démontrons une méthode pour mesurer la génération de force lors de la contraction du poisson zèbre muscles du tronc larvaire. mesures de force sont réalisés en plaçant une larve anesthésiés dans une chambre remplie d'une solution de sel. L'extrémité antérieure de la larve est reliée à un transducteur de force et l'extrémité postérieure de la larve est reliée à un contrôleur de longueur. Une contraction isométrique contraction est provoquée par une stimulation de champ électrique et de la réponse de force est enregistré pour l'analyse. La génération de forces lors de la contraction fournit une mesure de la santé musculaire globale et prévoit expressément une mesure de la fonction musculaire. Bien que nous décrivons cette technique pour une utilisation avec des larves de type sauvage, cette méthode peut être utilisée avec des larves génétiquement modifiés ou des larves traitées avec des médicaments ou des produits toxiques,pour caractériser des modèles de maladies musculaires et évaluer les traitements, ou pour étudier le développement des muscles, des blessures ou la toxicité chimique.
Poisson zèbre (Danio rerio) Les jeunes larves, 3-7 jours post-fécondation (DPF), sont de plus en plus reconnue comme un organisme utile pour la recherche sur le muscle squelettique. Les jeunes larves sont utilisés pour modéliser la maladie du muscle humain 1-9, évaluer les médicaments et les stratégies thérapeutiques 10-11, lésion musculaire de l'étude 12, 13-16 comprendre développement musculaire, et d'enquêter sur les muscles liés à la toxicité chimique 17-19. Études classiques dans ces domaines examiner la mesure dans laquelle le muscle sain est rendue anormale par manipulation génétique ou l'exposition à des substances toxiques, et certaines études examinent la mesure dans laquelle musculaire anormale réagit au traitement. Essentiel à la réussite de ces études est la capacité d'évaluer avec exactitude la santé des muscles.
Bien qu'il existe une variété de méthodes disponibles pour évaluer la santé des muscles chez les larves de poisson zèbre, peu fournir des informations directes sur la fonction musculaire. santé musculaire est généralement évaluée par appearance, évaluée par coloration histologique 6,8,11, immunologique 9,15,16,18, la microscopie optique 3,13, la microscopie électronique 3,4,14,16 ou biréfringence 7,9,11, mais ces techniques permettent des informations morphologiques seulement. Le tronc et les déplacements de la queue et la vitesse de nage 4,17 évaluer la fonction motrice, mais ce ne sont pas des mesures directes de la fonction musculaire, car ils reflètent également l'entrée de neurones, le métabolisme de l'énergie et d'autres processus.
En revanche, la mesure de génération de force lors de la contraction fournit une évaluation directe de la fonction musculaire et représente une mesure de la santé musculaire globale. Autres avantages de cette approche comprennent l'analyse des données simple et les résultats quantitatifs. Dans cet article, vidéo, nous proposons une procédure détaillée pour mesurer la génération de la force par les muscles larvaires, dans l'espoir que davantage de chercheurs vont utiliser cette méthode pour compléter les mesures existantes de la santé des muscles dans leurs recherches.
<pclass = "jove_content"> L'objectif global de cette méthode consiste à mesurer la génération de la force lors de la contraction du poisson zèbre muscles du tronc larvaire. Pour atteindre cet objectif, une larve de poisson-zèbre est anesthésié et placé dans une chambre remplie d'une solution saline. L'extrémité antérieure de la larve est reliée à un transducteur de force et l'extrémité postérieure de la larve est reliée à un contrôleur de longueur. activation musculaire est réalisé par stimulation de champ électrique, et le courant de stimulation et la longueur de la chenille sont ajustés pour produire la force de contraction maximale. Une contraction isométrique contraction est provoquée et de la réponse de force est enregistré pour l'analyse.Pour être clair, cette technique ne permet pas de mesurer les forces générées par les muscles des larves au cours de natation. Parce que les deux extrémités de la larve sont liés à l'équipement et parce que la larve reste anesthésié, il ne peut pas initier le mouvement pendant l'essai. De plus, la stimulation de champ active toutes les fibres du muscle à la fois pour induire un bilateral contraction, ce qui n'est pas ce qui se produit naturellement 20. Par conséquent, plutôt que de mesurer les forces réelles générées pendant la baignade, cette technique détermine la capacité de production de la force des muscles larvaires.
Nous avons utilisé cette technique pour démontrer la faiblesse musculaire dans un modèle de poisson zèbre de nemaline myopathie 21, ainsi que d'évaluer l'effet du traitement anti-oxydant sur la fonction musculaire dans un modèle de poisson zèbre de maladie multi-minicore 22. D'autres ont utilisé une technique similaire 23 pour examiner les effets d'un polluant de l'environnement sur la fonction musculaire 19.
Cette méthode mesure la génération de la force lors d'une contraction pour évaluer la fonction musculaire dans les muscles du tronc de larves de poisson zèbre. Bien contractions tétaniques peuvent être provoqués chez les larves de poisson zèbre (de par exemple 200 impulsions de stimulation / s pour une durée de 0,2 s), la force tétanique maximale n'est que de 10-15% supérieure à la force de contraction maximale. Par conséquent, la force générée lors d'une contraction est une mesure raisonnable de la capacité de production de force. Twitches sont préférés aux contractions tétaniques parce tics sont moins susceptibles de provoquer de déchirure ou de glisser sur les liens de suture.
Afin de générer des données significatives avec cette technique, la force de contraction maximale doit être réalisé pour chaque larve et la variabilité entre les groupes expérimentaux doit être minimisée. Avec ces objectifs à l'esprit, nous offrons les suggestions suivantes. Tout d'abord, prendre soin lors de l'amarrage de la larve au capteur de force et les tubes de contrôleur de longueur. Si les boucles de suture sont serrés tropbien, le fil de suture se couper à travers le tissu musculaire. Si les boucles de suture ne sont pas suffisamment serrées, la force générée par la chenille ne sera pas entièrement transmis au transducteur de force. Les deux situations, mais surtout le dernier, sous-estiment la force de contraction maximale. Deuxièmement, depuis tester plusieurs groupes expérimentaux peuvent prendre plusieurs heures (20-30 min / larve), alternent entre les groupes parce que les larves continuera à se développer au cours de la période d'essai.
Alors que certains de l'équipement mentionné est essentiel pour la mesure de la force de contraction maximale (par exemple capteur de force, stimulateur à courant), les autres éléments ne sont pas absolument nécessaires. Le système de longueur de sarcomère vidéo est souhaitable mais pas obligatoire. Comme alternative, une série de secousses peut être utilisé pour trouver la longueur optimale, au cours de laquelle la longueur de la larve est ajusté jusqu'à ce que la force de contraction maximale est atteinte. Un système de contrôle de la température n'est également pas absolument nécessaire. Contrôle de la température est critique quand meaSüring cinétique de contraction, qui sont très sensibles à la température, tandis que la force de contraction maximale n'est pas particulièrement sensible aux petites variations de température et peut être mesurée à la température ambiante. A noter que quelle que soit la température dans la chambre au cours des essais de la force, les larves doit être maintenu à la température optimale de croissance de 28,5 ° C 24 avant de forcer l'essai pour déterminer le stade précis.
Les larves sont testés dans une solution de Tyrode contenant tricaïne. Nous utilisons 0,02% (p / v) tricaïne, la concentration recommandée pour l'anesthésie 24, pour éliminer les contractions spontanées suscitées par le système nerveux et donc éviter la fatigue lors des tests de force. Tricaine facilite également l'étape tie-on et réduit le temps global de test. Cependant, nous observons que tricaïne y compris dans la solution de test réduit systématiquement la force de contraction maximale d'environ 30%. Un effet similaire a également été observée dans les muscles de la queue de têtard, où tricaine réduit génération de force après la transmission neuromusculaire a été bloqué, ce qui suggère que tricaïne a un effet direct sur le muscle 25. Tricaine peut réduire l'excitabilité des cellules musculaires, en réduisant la conductance de sodium à travers la membrane des cellules, comme c'est le cas dans les cellules nerveuses 26. D'autres options pour bloquer l'activation par motoneurones sont d-tubocurarine et α-bungarotoxine mais, contrairement tricaïne, ces composés ne sont pas la peau perméable et doivent être injectés directement dans la tête, la moelle épinière ou du cœur 27. Chercheurs individuels devront évaluer si oui ou non tricaïne est souhaitable pour leur application spécifique. Si tricaïne est inclus dans la solution d'essai, la concentration doit être cohérente entre les expériences et les chercheurs doivent vérifier que l'effet de la tricaïne ne varie pas entre les groupes expérimentaux.
Nous décrivons cette méthode pour les larves dès l'âge de 3 dpf et aussi vieux que 7 DPF. Bien que les fibres musculaires semblent être functional dès 17 heures après la fécondation, lorsque les mouvements de la queue spontanés commencent 27, la faible longueur de la queue avant le 3 DPF entrave lier la larve à l'équipement d'essai. Nous n'avons généralement pas testé larve après 7 DPF puisque de nombreux modèles de maladies ne survivent beaucoup plus longtemps que ce temps. Si vous testez les larves au-delà de 5 DPF, les larves doivent être nourris. Nous avons observé que les larves ont jeun petits muscles et générer de la force de contraction maximale inférieure de larves nourries, probablement en raison de la diminution vésicule ombilicale. Ainsi, il peut être souhaitable de tester les larves entre 3-5 DPF, afin d'éviter la variable supplémentaire de l'alimentation externe.
En résumé, nous décrivons une méthode quantitative et fiable pour mesurer la génération de la force lors d'une contraction de la secousse maximale de poisson zèbre muscles du tronc larvaire. Cette méthode peut être utilisée pour évaluer la santé globale des muscles des larves de poisson zèbre et prévoit notamment des informations sur la fonction musculaire. En plus de fournir des informations sur leampleur de génération de force, cette technique peut être utilisée pour étudier la cinétique de génération de force ou être adaptée pour étudier la fatigue musculaire 22. Bien que nous décrivons cette technique pour une utilisation avec des larves de type sauvage, cette méthode peut être utilisée pour les larves génétiquement modifiés ou de larves traitées avec des médicaments ou des produits toxiques, de caractériser des modèles de maladies musculaires et évaluer les traitements, ou pour étudier le développement musculaire, une lésion musculaire, ou musculaire liée à la toxicité chimique.
The authors have nothing to disclose.
Les auteurs tiennent à remercier Angela Busta de l'aide pour le poisson-zèbre élevage. Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (AG-020591 à SVB et 1K08AR054835 à JJD).
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |