力の測定は、開発、傷害、疾病、治療または化学毒性による筋機能の変化を示すために使用することができる。このビデオでは、我々は、ゼブラフィッシュ幼生体幹筋の最大収縮時の力を測定する方法を示しています。
ゼブラフィッシュの幼虫は筋肉の発達、筋肉疾患、筋肉関連の化学毒性のモデルを提供しますが、関連する研究は、多くの場合、筋肉の健康の機能的な措置を欠いている。このビデオの記事では、我々はゼブラフィッシュ幼生体幹筋の収縮時に力発生を測定する方法を示しています。力の測定は、塩溶液で満たされたチャンバー内に麻酔をかけ幼虫を置くことによって達成される。幼虫の前端は、力変換器に接続されており、幼虫の後端は、長さ·コントローラーに接続されています。等尺性単収縮は、電場刺激によって誘発され、力応答を分析のために記録される。収縮時の力発生は、全体的な筋肉の健康の尺度を提供し、特に筋機能の尺度を提供します。我々は、野生型幼虫で使用するために、この手法を説明したが、この方法は、遺伝子的に修飾された幼虫、または薬物または毒物で処理した幼虫で使用することができる筋肉の疾患モデルを特徴付けるとトリートメントを評価したり、筋肉の発達、けが、または化学毒性を研究するために。
ヤングゼブラフィッシュ( ゼブラフィッシュ )の幼虫、3-7日後に受精(DPF)は、ますます骨格筋研究のために有用な生物として認識されている。若い幼虫は、研究筋肉損傷12を薬や治療戦略10-11を評価し、モデルの人間の筋肉の疾患1-9に使用されている、筋肉の発達13-16を理解し、筋肉関連の化学毒性17-19を調査。これらの分野における代表的な研究では、健康的な筋肉が遺伝子操作や毒物への曝露によって異常なレンダリングされる度合いを調べ、いくつかの研究では、異常な筋肉が治療に反応する程度を調べます。これらの研究の成功に不可欠な、正確に筋肉の状態を評価する機能です。
ゼブラフィッシュ幼生の筋肉の状態を評価するために使用できるさまざまな方法がありますが、いくつかは、筋機能に関する直接的な情報を提供します。筋肉の健康は通常appearancによって評価されとして9,15,16,18を免疫組織染色6,8,11、、光学顕微鏡3,13、電子顕微鏡3,4,14,16、または複屈折7,9,11によって評価電子、しかし、これらの技術は提供する形態学的情報のみ。トランクとテール変位と遊泳速度4,17は運動機能を評価しますが、彼 らはまた、神経入力、エネルギー代謝、およびその他のプロセスを反映しているので、これらは、筋機能の直接的な対策ではありません。
対照的に、収縮時力発生を測定する筋肉機能の直接評価を提供し、全体的な筋肉の正常性の尺度を表す。このアプローチの利点は、追加された簡単なデータ分析と定量的な結果が含まれています。このビデオの記事では、我々はより多くの研究者が研究に筋肉の健康の既存の施策を補完するために、このメソッドを使用することを願って、幼虫の筋肉による力発生を測定するための詳細な手順を提供します。
<pクラス= "jove_content">この方法の全体的な目標は、ゼブラフィッシュ幼生体幹筋肉の収縮時の力の生成を測定することである。この目標を達成するために、ゼブラフィッシュの幼虫を麻酔し、食塩水で満たされたチャンバーに入れている。幼虫の前端は、力変換器に接続されており、幼虫の後端は、長さ·コントローラーに接続されています。筋肉の活性化は、電場刺激することによって達成され、刺激電流と幼虫の長さは、最大収縮力を生成するように調整される。等尺性単収縮が誘発され、力応答の分析のために記録される。明確にするために、この手法は、水泳中に幼虫の筋肉によって生成された力を測定していません。幼虫の両端には、機器に接続されており、幼虫は麻酔ままなので、それがテスト中に運動を開始することはできませんので。また、電界刺激億を誘導するために同時にすべての筋線維を活性化する当然20を発生するものではないateral収縮、。したがって、むしろ水泳中に生成された実際の力を測定するよりも、この技術は幼虫の筋肉の力発生機能を決定します。
我々は、マルチminicore疾患22のゼブラフィッシュモデルにおける筋肉の機能に酸化防止剤治療の効果を評価するために、並びに、ネマリンミオパチー21のゼブラフィッシュモデルにおける筋力低下を示すために、この技術を使用している。その他筋機能19環境汚染物質の影響を調べるために同様の手法23を使用している。
この方法では、ゼブラフィッシュの幼虫の体幹筋の筋機能を評価するために収縮時に力発生を測定します。強直収縮がゼブラフィッシュ幼生(0.2秒の期間200刺激パルス/秒によって)に誘発することができますが、最大の強縮力は最大収縮力よりも10〜15%大きい。したがって、単収縮時に発生する力は、能力を発生させる力の合理的な尺度である。けいれんは、リッピングや縫合の絆で滑りが発生する可能性が低いので、けいれんをテタヌス収縮よりも好ましい。
この手法の意味のあるデータを生成するために、最大の収縮力が各幼虫に対して達成すべきであると実験群との間のばらつきが最小化されるべきである。念頭に置いてこれらの目標により、我々は次の提案を提供しています。力変換器と長コントローラチューブに幼虫を結ぶときに最初に、世話をする。縫合糸ループがあまりに締められている場合あまり、縫合糸は、筋肉組織を切断します。縫合糸ループが十分に締め付けられていない場合には、幼虫が発生する力は完全に力変換器に伝達されない。両方の状況が、特に後者は、最大収縮力を過小評価する。幼虫は、テスト期間中に開発していきますので、第二に、複数の実験群のテスト以来、グループ間で交互に数時間(20〜30分/幼虫)、取ることができます。
前述の機器の一部が最大収縮力の測定( 例えば力変換器、現在の刺激)のために不可欠である一方、他の項目は絶対に必要ではありません。ビデオサルコメア長システムが望ましいが、必須ではありません。代替として、痙攣一連の最大収縮力が達成されるまで、幼虫の長さを調整する時に最適な長さを見つけるために使用することができる。温度制御システムは、必ずしも必要ではない。時測定温度制御が重要である最大収縮力は温度の小さな変化に特に敏感ではなく、室温で測定することができるのに対し、温度に非常に敏感であるジューリング収縮動態、。かかわらず、室内の温度の力試験中、幼虫の前に正確なステージングのテストを強制的に28.5°C 24の最適な成長温度に維持されなければならないことに留意されたい。
幼虫tricaineを含むタイロード溶液中でテストされます。私たちは神経系により誘発される自発的な収縮をなくすため、力のテスト中に疲労を防止するために、(w / v)のtricaine、麻酔24に推奨濃度は0.02%を使用しています。 Tricaineはまた、タイでのステップを容易にし、全体的なテスト時間を短縮します。しかし、我々は、試験溶液中にtricaineを含むことは常に約30%の最大収縮力を減少させることを観察する。同様の効果がtricaiここで、オタマジャクシ尾筋で観察されている神経筋伝達が遮断された後にneがtricaine 25が筋肉に直接影響を有することを示唆して、力発生を減少させた。それは神経細胞26の場合と同様にTricaineは、細胞膜を横切っナトリウムコンダクタンスを減少させることによって筋細胞の興奮性を低減することができる。運動ニューロンによる活性化を阻止するためのその他のオプションは、D-ツボクラリン及びα-ブンガロトキシンですが、tricaineとは異なり、これらの化合物は、皮膚浸透性ではなく、頭部、脊髄、心臓27に直接注入しなければなりません。個々の研究者はtricaineが彼らの特定のアプリケーションのために望ましいかどうかを評価する必要があるでしょう。 tricaineがテストソリューションに含まれている場合tricaineの効果が実験群間で変化しないことを確認する必要があり、濃度が実験や研究者の間で一貫している必要があります。
我々は3 DPFとして若く7 DPFと同じくらい古いように幼虫のためにこの方法を説明する。筋線維は、カンフーのように見えますが3 DPFは、テスト機器に幼虫を結ぶ妨げ前に自発テールの動きが27、尾の短い長さを開始17時間後の受精、早けれnctional。多くの疾患モデルは、この時間よりもはるかに長く生きていけないので、我々は一般的に7 DPF後に幼虫のテストは行わないでください。 5 DPF超え幼虫をテストする場合は、幼虫を供給すべきである。私たちは、未吸血幼虫が減少卵黄嚢が原因そう、小さい筋肉を持って飼育幼虫未満最大収縮力を発生することを観察した。したがって、外部給電の追加変数を避けるために、DPF 3-5間の幼虫をテストすることが望ましい場合がある。
要約すると、我々は、ゼブラフィッシュ幼虫の体幹筋肉の最大単収縮時の力の生成を測定するための定量的かつ信頼性のある方法が記載されている。この方法は、ゼブラフィッシュ幼生筋肉の全体的な健康状態を評価するために使用され、特に筋肉の機能に関する情報を提供することができます。についての情報を提供することに加えて力発生の大きさは、この技術は、力発生の動態を研究するために、または筋肉疲労22を研究するために適合させることに使用することができる。我々は、野生型幼虫で使用するためにこの技術を説明するが、この方法は、筋肉損傷は、筋疾患モデルを特徴付けるや治療を評価する、または筋肉の発達を研究するために、遺伝的に改変された幼虫又は薬物または毒物で処理した幼虫のために使用することができる、または筋肉関連の化学毒性。
The authors have nothing to disclose.
著者らは、ゼブラフィッシュの飼育の支援のためにアンジェラバスタに感謝します。この作品は、国立衛生研究所(AG-020591へSVBとJJDに1K08AR054835)によってサポートされていました。
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |