Krachtmetingen kunnen worden om veranderingen in spierfunctie gevolg van ontwikkeling, verwonding, ziekte, behandeling of chemische toxiciteit tonen. In deze video, tonen we een methode om kracht te meten tijdens een maximale contractie van de zebravis larven romp spieren.
Zebravis larven bieden modellen van spierontwikkeling, spierziekte en spier-gerelateerde chemische toxiciteit, maar verwante studies vaak niet functionele maatregelen van spieren gezondheid. In deze video artikel, demonstreren we een methode om kracht generatie te meten tijdens het samentrekken van de zebravis larven romp spieren. Krachtmetingen worden bereikt door het plaatsen van een verdoofde larve in een kamer gevuld met een zoutoplossing. Het voorste uiteinde van de larve is gekoppeld aan een krachtopnemer en het achterste uiteinde van de larve is gebonden aan een lengte controller. Een isometrische twitch contractie wordt opgewekt door elektrische veld stimulatie en de kracht respons is opgenomen voor analyse. Troepenmacht tijdens samentrekking geeft een maat voor de algehele gezondheid spier en in het bijzonder biedt een maatstaf voor de spierfunctie. Hoewel deze techniek beschrijven voor gebruik met wildtype larven kan deze werkwijze worden gebruikt met genetisch gemodificeerde larven of larven behandeld met drugs of toxische stoffen,naar spierziekte modellen karakteriseren en behandelingen te evalueren, of om spierontwikkeling, verwonding, of chemische toxiciteit te bestuderen.
Jonge zebravis (Danio rerio) larven, 3-7 dagen na de bevruchting (DPF), worden steeds meer erkend als een nuttig organisme voor skeletspieren onderzoek. Jonge larven worden gebruikt voor het model menselijke spierziekte 1-9, evalueren drugs en therapeutische strategieën 10-11, studie spierblessure 12, begrijp spierontwikkeling 13-16, en te onderzoeken spier-gerelateerde chemische giftigheid 17-19. Typische studies in deze gebieden te onderzoeken in hoeverre gezonde spier abnormale gemaakt door genetische manipulatie of blootstelling aan toxische agentia, en sommige studies onderzoeken de mate waarin abnormale spier op de behandeling reageert. Essentieel belang voor het succes van deze studies is de mogelijkheid om nauwkeurig te beoordelen spieren gezondheid.
Hoewel er een verscheidenheid van methoden beschikbaar om spieren gezondheid te beoordelen in de zebravis larven, weinig directe informatie over de spierfunctie. Muscle gezondheid wordt gewoonlijk geëvalueerd door appearance, zoals beoordeeld door histologische kleuring 6,8,11, immunostaining 9,15,16,18, lichtmicroscopie 3,13, elektronenmicroscopie 3,4,14,16, of dubbele breking 7,9,11, maar deze technieken bieden morfologische informatie alleen. Romp en staart verplaatsingen en zwemmen snelheid 4,17 evalueren motorische functie, maar deze zijn niet direct maatregelen van spierfunctie omdat ze weerspiegelen ook de neurale input, energiemetabolisme, en andere processen.
In tegenstelling, het meten van de troepenmacht tijdens samentrekking geeft een directe beoordeling van de spierfunctie en vertegenwoordigt een maat voor de algehele gezondheid spier. Extra voordelen van deze aanpak zijn eenvoudig data-analyse en kwantitatieve resultaten. In deze video artikel geven we een gedetailleerde procedure voor het meten van de troepenmacht door larvale spieren, in de hoop dat meer onderzoekers deze methode zullen gebruiken om bestaande maatregelen van spieren gezondheid aanvullen in hun onderzoek.
<pclass = "jove_content"> Het algemene doel van deze methode is om de troepenmacht te meten tijdens het samentrekken van de zebravis larven romp spieren. Om dit doel te bereiken, een zebravis larve is verdoofd en geplaatst in een kamer gevuld met een zoutoplossing. Het voorste uiteinde van de larve is gekoppeld aan een krachtopnemer en het achterste uiteinde van de larve is gebonden aan een lengte controller. Spieractiviteit wordt bereikt door elektrisch veld stimulatie en de stimulatie stroom en de lengte van de larven worden ingesteld voor een optimale twitch kracht produceren. Een isometrische twitch contractie wordt opgewekt en de kracht respons is opgenomen voor analyse.Om duidelijk te zijn, is deze techniek niet te meten krachten die ontstaan door larvale spieren tijdens het zwemmen. Omdat beide uiteinden van de larven zijn gebonden aan apparatuur en omdat de larve blijft narcose kan niet leiden beweging tijdens de test. Bovendien veldstimulatie activeert alle spiervezels tegelijkertijd een bil inducerenateral contractie, wat niet is wat van nature 20. Daarom, in plaats van het meten van de werkelijke krachten die tijdens het zwemmen, deze techniek bepaalt de kracht genererende capaciteit van de larvale spieren.
Wij hebben deze techniek gebruikt om spierzwakte in een zebravis model van nemaline myopathie 21, alsmede het effect van antioxidantbehandeling op spierfunctie evalueren een zebravis model van multi-MiniCore ziekte 22 tonen. Anderen hebben een soortgelijke techniek 23 om de gevolgen van een milieuvervuiling op de spierfunctie 19 onderzoeken gebruikt.
Deze methode meet de troepenmacht tijdens een twitch om de spierfunctie te evalueren in rompspieren van zebravis larven. Hoewel tetanische contracties kunnen worden uitgelokt in de zebravis larven (bijvoorbeeld door 200 stimulatie pulsen / sec voor een duur van 0,2 sec), de maximale tetanische kracht is slechts 10-15% groter is dan de maximale twitch kracht. Daarom is de kracht die tijdens een twitch een redelijke mate van kracht genererende mogelijkheden. Samentrekkingen zijn voorkeur boven tetanische contracties omdat samentrekkingen hebben minder kans op scheuren of uitglijden op de hechting banden veroorzaken.
Om zinvolle gegevens met deze techniek te genereren, moet maximale twitch kracht worden bereikt voor elke larve en de variabiliteit tussen de experimentele groepen moet worden geminimaliseerd. Met deze doelstellingen in het achterhoofd, bieden wij de volgende suggesties. Ten eerste, moet u erop letten wanneer de koppelverkoop van de larve van de krachtopnemer en de lengte controller buizen. Als de hechting lussen te worden aangedraaidveel, zal de hechting dwars door het spierweefsel. Indien de hechting lussen niet voldoende aangedraaid, de kracht die door de larven niet volledig overgebracht op de krachtopnemer. Beide situaties, maar vooral de laatste, onderschatten maximale twitch kracht. Ten tweede, omdat het testen van meerdere experimentele groepen kan enkele uren (20-30 min / larve), afwisselend tussen groepen te nemen, omdat de larven zal blijven ontwikkelen tijdens de testperiode.
Hoewel sommige van de genoemde apparatuur is essentieel voor het meten van de maximale twitch kracht (bv. krachtopnemer, huidige stimulator), andere items zijn niet absoluut noodzakelijk. De video sarcomeer lengte is gewenst maar niet vereist. Als alternatief kan een reeks samentrekkingen worden om optimale lengte, waarbij de lengte van de larve wordt aangepast tot maximum samentrekkende kracht worden behaald. Een temperatuurregeling is ook niet absoluut noodzakelijk. Temperatuurregeling is kritisch wanneer measuring twitch kinetiek, die zeer gevoelig zijn voor temperatuur, terwijl maximale twitch kracht niet bijzonder gevoelig is voor kleine veranderingen in de temperatuur en kan worden gemeten bij kamertemperatuur. Merk op dat, ongeacht de temperatuur in de kamer tijdens krachtmetingen, de larven worden ° C 24 voordat kracht gehandhaafd op de optimale groeitemperatuur van 28,5 testen voor nauwkeurige staging.
De larven worden getest in een Tyrodes oplossing die tricaïne. We gebruiken 0.02% (w / v) tricaïne, de concentratie aanbevolen voor anesthesie 24 tot spontane contracties opgewekt door het zenuwstelsel te elimineren en dus tijdens krachtmetingen vermoeidheid te voorkomen. Tricaïne vergemakkelijkt ook de tie-op stap en vermindert de totale testtijd. Echter, we dat ook tricaïne in de testoplossing consequent vermindert de maximale twitch kracht met ongeveer 30%. Een soortgelijk effect is ook waargenomen in kikkervisje staart spier, waarbij tricaine verminderde kracht generatie na neuromusculaire transmissie is geblokkeerd, wat suggereert dat tricaïne heeft een direct effect op de spieren 25. Tricaïne kan spiercel prikkelbaarheid verminderen door natrium conductantie over het celmembraan, zoals in zenuwcellen 26. Andere opties voor het blokkeren van activatie van motoneuronen zijn d-tubocurarine en α-bungarotoxine maar in tegenstelling tricaïne zijn deze verbindingen niet-permeabele huid en moet rechtstreeks worden geïnjecteerd in de kop, ruggenmerg, of het hart 27. Individuele onderzoekers zal moeten beoordelen of tricaïne wenselijk is voor hun specifieke toepassing. Als tricaïne is opgenomen in de testoplossing, moet de concentratie verenigbaar tussen experimenten en onderzoekers moet controleren of het effect van de tricaïne niet varieert tussen experimentele groepen.
We beschrijven deze methode voor larven zo jong als 3 dpf en zo oud als 7 dpf. Hoewel spiervezels lijken functional zo vroeg als 17 uur na de bevruchting, als spontane staart bewegingen beginnen 27, de korte lengte van de staart vóór 3 dpf hindert de binding van de larve van de testapparatuur. We hebben meestal geen testen larve na 7 dpf omdat veel ziekte-modellen niet veel langer dan deze tijd te overleven. Als test larven dan 5 dpf moet de larven worden gevoed. We hebben geconstateerd dat unfed larven hebben kleinere spieren en het genereren van minder maximale twitch kracht dan gevoed larven, waarschijnlijk te wijten aan de afnemende dooierzak. Aldus kan het wenselijk zijn larven tussen 3-5 dpf te testen, de extra variabele externe voeding voorkomen.
Samengevat beschrijven we een kwantitatieve en betrouwbare methode voor het meten van kracht genereren tijdens een maximale twitch samentrekking van zebravis larven trunk spier. Deze methode kan worden gebruikt om de algemene gezondheid van de zebravis larven spier beoordelen en specifiek geeft informatie over spierfunctie. Naast het verstrekken van informatie over degrootte van de kracht generatie, kan deze techniek worden gebruikt om de kinetiek van de troepenmacht studeren of worden aangepast aan spiervermoeidheid 22 bestuderen. Hoewel deze techniek beschrijven voor gebruik met wildtype larven kan deze werkwijze worden toegepast voor genetisch gemodificeerde larven of larven behandeld met drugs of toxische stoffen om spier ziektemodellen karakteriseren en behandelingen evalueren of spierontwikkeling, spierverwonding of studie spier-gerelateerde chemische toxiciteit.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs danken Angela Busta voor hulp bij zebravissen veehouderij. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (AG-020591 naar SVB en 1K08AR054835 te JJD).
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |