قياسات القوة يمكن أن تستخدم لإظهار التغيرات في وظيفة العضلات نتيجة للتنمية، والإصابة، والمرض، والعلاج أو السمية الكيميائية. في هذا الفيديو، ونحن يبرهن على وجود طريقة لقياس قوة خلال انكماش القصوى من الزرد العضلات الجذع اليرقات.
اليرقات الزرد تقديم نماذج من تنمية العضلات، وأمراض العضلات والعضلات المتصلة السمية الكيميائية، ولكن غالبا ما تفتقر إلى الدراسات ذات الصلة تدابير وظيفية للصحة العضلات. في هذه المقالة الفيديو، ونحن يبرهن على وجود طريقة لقياس قوة الجيل أثناء انقباض عضلة الجذع الزرد اليرقات. يتم إنجاز قياسات القوة عن طريق وضع اليرقة تخدير في غرفة مليئة محلول ملحي. ويرتبط نهاية الأمامي من اليرقة إلى محول القوة وقيدت نهاية الخلفي من يرقة إلى وحدة تحكم طول. وأثارت انكماشا نشل متساوي القياس عن طريق تحفيز الحقل الكهربائي ويتم تسجيل استجابة قوة للتحليل. جيل القوة خلال الانكماش يوفر مقياسا لصحة العضلات عموما وعلى وجه التحديد على قدر من وظيفة العضلات. على الرغم من أننا وصف هذه التقنية للاستخدام مع البرية من نوع اليرقات، ويمكن استخدام هذه الطريقة مع يرقات المعدلة وراثيا أو مع يرقات تعامل مع العقاقير أو المواد السامة،لتوصيف نماذج مرض في العضلات وتقييم العلاجات، أو لدراسة تنمية العضلات، والإصابة، أو السمية الكيميائية.
يتم التعرف على نحو متزايد الشباب الزرد (دانيو rerio) اليرقات، 3-7 أيام بعد الإخصاب (DPF)، كما كائن مفيد للبحوث العضلات والهيكل العظمي. وتستخدم اليرقات الشباب إلى نموذج الإنسان مرض في العضلات 1-9، وتقييم العقاقير والاستراتيجيات العلاجية 10-11، الدراسة 12 اصابة في العضلات، فهم العضلات التنمية 13-16، والتحقيق في العضلات المتصلة السمية الكيميائية 17-19. دراسات نموذجية في هذه المناطق فحص الدرجة التي يتم تقديمها العضلات صحية غير طبيعية من خلال التلاعب وراثية أو التعرض للسميات، وبعض الدراسات دراسة الدرجة التي يستجيب العضلات غير طبيعية للعلاج. بالغ الأهمية لنجاح هذه الدراسات هو القدرة على تقييم دقيق الصحية العضلات.
في حين أن هناك مجموعة متنوعة من الطرق المتاحة لتقييم صحة العضلات في اليرقات الزرد، وعدد قليل تقديم معلومات مباشرة حول وظيفة العضلات. عادة ما يتم تقييم الحالة الصحية للعضلات من قبل appearancه، وفقا لتقييم تلطيخ النسيجية 6،8،11، المناعية 9،15،16،18، المجهر الضوئي 3،13، والإلكترون المجهري 3،4،14،16، أو الانكسار 7،9،11، ولكن هذه التقنيات توفير المعلومات الصرفية فقط. الجذع والتشريد الذيل وسرعة السباحة 4،17 تقييم وظيفة الحركة، ولكن هذه ليست التدابير المباشرة من وظيفة العضلات نظرا لأنها تعكس أيضا المدخلات العصبية، والتمثيل الغذائي والطاقة، وغيرها من العمليات.
في المقابل، قياس توليد القوة خلال الانكماش يوفر التقييم المباشر من وظيفة العضلات ويمثل مقياسا لصحة العضلات بشكل عام. فوائد إضافية من هذا النهج يشمل تحليل البيانات واضحة والنتائج الكمية. في هذه المقالة الفيديو، ونحن نقدم إجراءات مفصلة لقياس توليد القوة من قبل العضلات اليرقات، على أمل أن المزيد من الباحثين سوف تستخدم هذا الأسلوب لتكمل التدابير القائمة من صحة العضلات في أبحاثهم.
<pالطبقة = "jove_content"> ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو لقياس قوة الجيل أثناء انقباض عضلة الجذع الزرد اليرقات. لتحقيق هذا الهدف، اليرقة الزرد هو تخدير، ووضع في غرفة مليئة محلول ملحي. ويرتبط نهاية الأمامي من اليرقة إلى محول القوة وقيدت نهاية الخلفي من يرقة إلى وحدة تحكم طول. ويتم إنجاز تنشيط العضلات عن طريق تحفيز الحقل الكهربائي، ويتم ضبط الحالي التحفيز وطول اليرقة لإنتاج قوة نشل أقصى. وأثارت انكماشا نشل متساوي القياس ويتم تسجيل استجابة قوة للتحليل.أن تكون واضحة، وهذا الأسلوب لا يقيس القوات التي تولدها عضلات اليرقات أثناء السباحة. لأن ترتبط طرفي اليرقة إلى معدات ولأن يرقة يبقى تخدير، فإنه لا يمكن الشروع في الحركة أثناء الاختبار. وعلاوة على ذلك، والتحفيز حقل ينشط جميع ألياف العضلات في نفس الوقت للحث على مليارانكماش ateral، الذي ليس هو ما يحدث بشكل طبيعي 20. لذلك، بدلا من قياس القوى الفعلية المتولدة أثناء السباحة، وهذا الأسلوب يحدد قدرة توليد قوة عضلات اليرقات.
وقد استخدمنا هذه التقنية لإثبات ضعف العضلات في نموذج الزرد من اعتلال عضلي خيطي 21، وكذلك لتقييم تأثير العلاج المضادة للأكسدة على وظيفة العضلات في نموذج الزرد من مرض متعدد minicore 22. وقد استخدمت تقنية مماثلة الآخرين 23 لدراسة الآثار المترتبة على الملوثات البيئية على وظيفة العضلات 19.
يقيس هذا الأسلوب في توليد القوة أثناء نشل لتقييم وظيفة عضلة في عضلات الجذع من اليرقات الزرد. على الرغم من تقلصات كزازي يمكن استخلاصها في اليرقات الزرد (على سبيل المثال بنسبة 200 التحفيز البقول / ثانية لمدة 0.2 ثانية)، القوة كزازي الحد الأقصى هو فقط 10-15٪ أكبر من قوة نشل أقصى. ولذلك، فإن القوة المتولدة أثناء نشل هو مقياس معقول من القدرة على توليد قوة. ويفضل أكثر من تشنجات تقلصات كزازي بسبب تشنجات هي أقل احتمالا للتسبب تمزيق أو الانزلاق في العلاقات خياطة.
من أجل توليد بيانات ذات مغزى مع هذه التقنية، ينبغي أن يتحقق قوة نشل أقصى لكل يرقة وينبغي التقليل من التباين بين المجموعات التجريبية. مع هذه الأهداف في الاعتبار، ونحن نقدم الاقتراحات التالية. الأول، اتخاذ الحذر عند ربط اليرقة إلى محول القوة وأنابيب تحكم طول. إذا يتم شد الحلقات خياطة جدامن ذلك بكثير، فإن خياطة قطع طريق الأنسجة العضلية. إذا لم يتم إحكام حلقات خياطة بما فيه الكفاية، والقوة المتولدة من يرقة لن تنتقل بالكامل إلى محول القوة. كلتا الحالتين، ولكن خصوصا الأخير، نقلل من قوة نشل أقصى. الثانية، منذ اختبار مجموعات تجريبية متعددة يمكن أن يستغرق عدة ساعات (20-30 دقيقة / يرقة)، بالتناوب بين المجموعات لأن يرقات سوف تستمر في النمو خلال فترة الاختبار.
في حين أن بعض المعدات المذكورة أمر ضروري لقياس القوة نشل أقصى (على سبيل المثال محول القوة، مشجعا الحالية)، والبنود الأخرى ليست ضرورية على الإطلاق. وقسيم عضلي نظام طول الفيديو هو مرغوب فيه ولكن ليس المطلوب. وكبديل لذلك، سلسلة من تشنجات يمكن استخدامها للعثور على طول الأمثل، وخلالها يتم ضبط طول اليرقة حتى يتم تحقيق أقصى قدر من قوة نشل. نظام التحكم في درجة الحرارة هو أيضا ليس ضروريا على الاطلاق. التحكم في درجة الحرارة أمر بالغ الأهمية عندما MEAsuring حركية نشل، التي تعتبر حساسة للغاية لدرجة الحرارة، في حين أن قوة نشل أقصى ليست حساسة بشكل خاص للتغيرات طفيفة في درجة الحرارة ويمكن أن يقاس في درجة حرارة الغرفة. لاحظ أنه بغض النظر عن درجة الحرارة في مقصورة خلال اختبار القوة، ينبغي الحفاظ على اليرقات في درجة الحرارة المثلى للنمو من 28.5 ° C 24 قبل فرض اختبار لانطلاق دقيقة.
ويتم اختبار اليرقات في حل Tyrodes تحتوي على تريكين. نحن نستخدم 0.02٪ (W / V) تريكين، وتركيز أوصى للتخدير 24، للقضاء على تقلصات عفوية أثار من قبل الجهاز العصبي، وبالتالي منع التعب أثناء اختبار قوة. يسهل تريكين أيضا التعادل في خطوة ويقلل من وقت الاختبار الشامل. ومع ذلك، فإننا نلاحظ أن تريكين بما في ذلك في حل الاختبار باستمرار يقلل من قوة نشل أقصى ما يقرب من 30٪. كما لوحظ تأثير مماثل في العضلات الذيل الشرغوف، حيث tricaiشمال شرق خفض توليد قوة بعد أن منعت انتقال العصبية والعضلية، مما يوحي بأن تريكين له تأثير مباشر على العضلات 25. تريكين قد يقلل من استثارة الخلايا العضلية عن طريق الحد من تصرف الصوديوم عبر غشاء الخلية، كما هو الحال في الخلايا العصبية 26. خيارات أخرى لمنع تفعيل من قبل العصبونات الحركية هي D-توبوكورارين وα-بنغاروتوكسين ولكن، على عكس تريكين، هذه المركبات ليست قابلة للاختراق الجلد، ويجب أن يتم حقنه مباشرة في الرأس والحبل الشوكي، أو قلب 27. سوف تحتاج المحققين الفردية لتقييم ما إذا كان أو لا تريكين أمر مرغوب فيه لتطبيقها محددة. إذا تم تضمين تريكين في حل الاختبار، ويجب أن يكون تركيز متسقة بين التجارب والباحثين وينبغي التحقق من أن تأثير تريكين لا تختلف بين المجموعات التجريبية.
وصفنا هذه الطريقة ليرقات لا تزيد أعمارهم عن 3 DPF وقديمة قدم 7 DPF. على الرغم من ألياف العضلات يبدو أن فوnctional في أقرب وقت 17 ساعة بعد الإخصاب، عندما تبدأ حركات عفوية ذيل 27، وطول قصيرة من الذيل قبل يعيق 3 DPF ربط اليرقة إلى معدات الاختبار. نحن عادة لا اختبار اليرقة بعد 7 DPF منذ العديد من النماذج المرض لا يعيش لفترة أطول بكثير من هذا الوقت. إذا اختبار اليرقات خارج 5 DPF، ويجب أن تغذى اليرقات. وقد لاحظنا أن اليرقات unfed ديك العضلات الصغيرة وتوليد قوة نشل أقل من الحد الأقصى لتغذية اليرقات، على الأرجح بسبب تناقص الكيس المحي. وبالتالي قد يكون من المرغوب فيه لاختبار اليرقات بين 3-5 DPF، لتجنب متغير إضافية من التغذية الخارجية.
وباختصار، نحن تصف طريقة الكمي وموثوق بها لقياس قوة جيل خلال انكماش نشل القصوى من الزرد العضلات الجذع اليرقات. ويمكن استخدام هذه الطريقة لتقييم الصحة العامة للعضلة اليرقات الزرد وعلى وجه التحديد المعلومات حول وظيفة العضلات. بالإضافة إلى توفير المعلومات حولحجم توليد القوة، وهذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة حركية جيل القوة أو تكييفها لدراسة العضلات والتعب 22. على الرغم من أننا وصف هذه التقنية للاستخدام مع البرية من نوع اليرقات، وهذه الطريقة يمكن أن تستخدم في يرقات المعدلة وراثيا أو ليرقات تعامل مع العقاقير أو المواد السامة، لتوصيف نماذج مرض في العضلات وتقييم العلاجات، أو لدراسة تنمية العضلات، اصابة في العضلات، أو العضلات المتصلة السمية الكيميائية.
The authors have nothing to disclose.
المؤلفان بالشكر أنجيلا بوستا للحصول على المساعدة مع الزرد تربية. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (AG-020591 إلى SVB و1K08AR054835 إلى JJD).
REAGENTS | |||
Tricaine powder | Sigma-Aldrich | A5040 | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | 223506 | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M2670 | |
Sodium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich | S0751 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6297 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate | Sigma-Aldrich | E5134 | |
EQUIPMENT | |||
Nonsterile-suture | Ashaway Line & Twine | S30002 | USP 10/0 monofilament nylon (3 ply) |
Forceps | Fine Science Tools | 11251-20 | Dumont #5 |
Spring scissors | Fine Science Tools | 15000-08 | Vannas |
Stereo microscope | Leica Microsystems | MZ8 | Illuminated with Fostec EKE ACE I light source |
Force transducer | Aurora Scientific | 400A | |
Length controller | Aurora Scientific | 318B | |
XYZ positioning devices | Parker Hannifin | 3936M | |
Thermometer | Physitemp | BAT-12 | |
Disposable transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-9AM | Cut end to widen opening and facilitate larva transfer |
Petri dish | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-8B | Cut end (and fire-polish) to widen opening and facilitate larva transfer |
Inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axiovert 100 | |
Water bath circulator | Neslab Instruments | RTE-111 | |
Temperature controller | Alpha Omega Instruments | Series 800 | |
Stimulator | Aurora Scientific | 701C | High-power, follow stimulator |
Video sarcomere length system | Aurora Scientific | 900B-5A | |
LabVIEW software | National Instruments | ||
Oscilloscope | Nicolet Technologies | ACCURA 100 | |
Microblade | Fine Science Tools | 10050-00 | |
Microblade holder | Fine Science Tools | 10053-13 | |
Data analysis software (Signo) | Alameda Applied Sciences |