Summary

İmmünoterapi için Tümör Antijen-yüklü Olgun dendritik hücreler hazırlanması

Published: August 01, 2013
doi:

Summary

Tümör immünoterapide kullanım için otolog dendritik hücreler, çok sayıda (DC'ler) oluşturmak için en yaygın olarak kullanılan yöntem tarif edilmektedir. Gibi bir yöntem monositlerden DC'ler ayırt etmek için, IL-4 ve GM-CSF kullanır. Bu hastaya geri enjekte edilmeden önce olgunlaşmamış DC'lerin olgun ve daha sonra antijen ile yüklenir için uyarılır.

Abstract

Klinik çalışmalarda antijen yüklü DC aşıları güvenli ve tümörler 1 için umut verici tedavi olduğunu kurduk da, klinik etkinliği kurulacak kalır. Bir yöntem olup, İyi Üretim Prosesi (GMP) kurallarına uygun olarak hazırlanan, aşağıda açıklanan klinik çalışmalar 2 DC'lerin sayıda üretmek için en yaygın ex vivo olarak hazırlama yönteminin bir iyileştirmedir.

Bizim yöntem sentetik TLR 3 agonisti DC uyarmak için Polyinosinic-polisitidilik Asit-poli-L-lisin Karboksimetilselüloz (Poli-ICLC) kullanır. Daha önceki çalışmada, CD83 ve CD86, interlökin-12 indüksiyonu (IL-12), tümör nekroz faktörü (TNF), interferon gama-kaynaklı bir regülasyonu ile değerlendirildi gibi poli-ICLC insan DC'ler için en güçlü tek olgunlaşmasını teşvik olduğunu tespit Protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) ve tip I interferonlar (IFN), ve en az interlökin 10 (IL-10) üretimi. </p>

DC lökaferezis ile elde edilen dondurulmuş periferik kan mononükleer hücreleri (PBMC) ayrılıyor. PBMC, Ficoll gradyan santrifüj ile izole edildi ve alikotlar halinde dondurulur. 1. günde, PBMC çözülmüş ve ° C doku kültürü inkübatöründe 37 de 1-2 saat inkübasyondan sonra plastik yüzeye yapışma monositler seçmek için doku kültürü şişeleri üzerine kaplanmıştır. İnkübasyondan sonra, lenfositler yıkanır ve yapışık monositler interlökin-4 varlığında (IL-4) ve olgunlaşmamış DC'lerin ayırt etmek için, granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), 5 gün boyunca kültürlenmiştir. 6. günde, olgunlaşmamış DC'lerin aşı kalitesi için bir kontrol olarak hizmet eder ve aşı 3 immünojenisitesini artırmak olabilir anahtar deliği limpet hemosiyanin (KLH) proteini ile pals edilmiştir. DC'ler olgunlaşması için uyarılmış peptit antijen ile yüklenir ve bir gece inkübe edilir. 7. günde, hücreler yıkandı ve ihtiva eden 1 ml'lik kesirler dondurulur4 – kontrollü bir sınıf dondurucu kullanarak 20 x 10 6 hücre. DH partiler için çok sürümü test yapılır ve hasta enjekte edilmeden önce minimum teknik özellikleri karşılamalıdır.

Protocol

1. PBMC 4 İzolasyon ve Kriyoprezervasyon Aseptik başak bir plazma transfer seti kullanarak lökaferezis torbaya erişim limanlarından biri. 60 ml'lik şırınga kullanarak, steril bir 500 ml'lik şişe içine hastadan elde edilen lökaferezis aktarın. Oda sıcaklığında RPMI kullanarak orijinal ses 2x lökaferezis hacmi ayarlayın. Iyice karıştırın. Yavaşça Ficoll-Paque PLUS şişe karıştırın. Steril bir 50 ml'lik konik bir tüp içine 12 ml Ficoll Pa…

Representative Results

10 arası – Başlangıç ​​PBMC'ler% 20, kültür periyodunun sonunda DC'ler farklılaşırlar. Olgun DC CD11c olan +, CD14-, CD83 +, CD40 + ve CCR7 + (Şekil 1). Bunlar MHC sınıf I ve sınıf II molekülleri ile birlikte uyaran moleküller CD80 ve CD86 arasında yüksek düzeyde ifade eder. Diğer TLR agonistleri 14 ile karşılaştırıldığında, poli-ICLC da PDL-1 daha düşük düzeyde arttırmaktadır. Ayrıca, bu Poli-IC-olgunlaşmış DC'ler salgılar büyük IL-12 …

Discussion

Faz I ve II, monosit türevli DC'lerin klinik çalışmalarda, hastalar, ancak klinik başarıya 1 sınırlı olmuştur bağışıklık tepkileri ortaya göstermiştir. Bu tümör immünoterapötik kullanım için en uygun DC oluşturmak için nasıl fikir birliği eksikliği kısmen olabilir. Klinik dereceli DC oluşturmak için birçok yolu olmasına rağmen, bu yöntemler monositler, olgunlaşma ikna etmek için kullanılan uyarı ve antijen yükleme yöntemleri ayırt etmek için kullanılan sitokinle…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar Poly-ICLC armağanı için Andres Salazar (Oncovir, Inc) teşekkür etmek istiyorum.

Materials

Reagent/Supplies/Equipment Manufacturer Catalog No.
RPMI-1640 medium with L-glutamine BioWhittaker 12-702F
1M HEPES buffered saline BioWhittaker 17-737E
Phosphate buffered saline (PBS) BioWhittaker 17-516F
Human albumin, 25% solution USP Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM GE Healthcare 17-5442-03
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Sterile saline USP Hospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec 170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml Berlex A02266
MACS GMP IL-4 Miltenyi Biotec 170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml Oncovir NA
VACMUNE KLH Biosyn
225 sq cm EasyFlasks Nalgene Nunc 159934
Falcon 6-well tissue culture plates Becton Dickinson 353046
1.8 ml CryoTube vials Nalgene Nunc 377267
Controlled Rate Freezer Thermo CryoMed

References

  1. Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
  2. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
  3. Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
  4. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  5. Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
  6. Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
  7. O’Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
  8. de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
  9. Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
  10. Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
  11. Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
  12. Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
  13. Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
  14. Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
  15. Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
  16. Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
  17. Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
  18. Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
  19. Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
  20. Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
  21. Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
  22. Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
  23. Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
  24. Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).

Play Video

Cite This Article
Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), e50085, doi:10.3791/50085 (2013).

View Video