Summary

Voorbereiding van de Tumor antigenen opgeladen Mature dendritische cellen voor immunotherapie

Published: August 01, 2013
doi:

Summary

De meest gebruikte methode voor het genereren van grote aantallen autologe dendritische cellen (DCs) voor gebruik bij tumor immunotherapie beschreven. De methode maakt gebruik van IL-4 en GM-CSF om DCs te onderscheiden van monocyten. De onrijpe DCs worden gestimuleerd om te rijpen en daarna beladen met antigenen voordat ze geïnjecteerd terug in de patiënt.

Abstract

Hoewel uit klinische studies hebben aangetoond dat antigeen-beladen DC vaccins veilig en veelbelovende therapie voor tumoren 1 zijn, blijft hun klinische werkzaamheid vast te stellen. De hieronder beschreven methode, opgesteld in overeenstemming met de Good Manufacturing Process (GMP) richtlijnen, is een optimalisatie van de meest voorkomende ex vivo bereidingswijze voor het genereren van grote aantallen DCs voor klinische studies 2.

Onze werkwijze gebruikt de synthetische TLR 3 agonist Polyinosinic-Polycytidylic zuur poly-L-lysine Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC) bij de DC stimuleren. Onze eerdere studie aangetoond dat Poly-ICLC is de meest krachtige individuele rijping stimulans voor humane DCs zoals beoordeeld door een opregulatie van CD83 en CD86, inductie van interleukine-12 (IL-12), tumornecrosefactor (TNF), interferon gamma-geïnduceerde proteïne 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) en type I interferonen (IFN) en minimale interleukine 10 (IL-10) productie. </p>

DCs gedifferentieerd uit ingevroren perifeer bloed mononucleaire cellen (PBMC's) verkregen door leukaferese. PBMC's worden geïsoleerd door Ficoll gradiëntcentrifugatie en ingevroren in porties. Op dag 1 worden PBMC's ontdooid en uitgeplaat op weefselkweek kolven te selecteren op monocyten die na 1-2 uur incubatie bij 37 ° C in de weefselkweek incubator zich aan het plastic oppervlak. Na incubatie worden de lymfocyten afgewassen en hechtende monocyten gekweekt gedurende 5 dagen in de aanwezigheid van interleukine-4 (IL-4) en granulocyt macrofaag kolonie-stimulerende factor (GM-CSF) te differentiëren tot rijpe DCs. Op dag 6 worden onrijpe DC gepulst met keyhole limpet hemocyanine (KLH) eiwit dat dient als een controle voor de kwaliteit van het vaccin en kan de immunogeniciteit van het vaccin te verhogen 3. De DCs worden gestimuleerd om te rijpen, geladen met peptide-antigenen, en overnacht geïncubeerd. Op dag 7 werden de cellen gewassen en bevroren in hoeveelheden van 1 ml met4-20 x 10 6 cellen met behulp van een gecontroleerde-tarief vriezer. Veel vrijgave testen voor de partijen van DC's wordt uitgevoerd en moeten voldoen aan de minimale specificaties voordat ze geïnjecteerd in patiënten.

Protocol

1. Isolatie en cryopreservatie van PBMC 4 Aseptisch spike een van de toegangspoorten in de leukaferese zak met behulp van een plasma transferset. Met behulp van een 60 ml spuit, breng de leukaferese verkregen van patiënten in een steriele 500 ml fles. Het volume van de leukaferese zijn oorspronkelijke volume met kamertemperatuur RPMI 2x. Meng goed. Meng voorzichtig de fles Ficoll-Paque PLUS. Voeg 12 ml Ficoll-Paque PLUS in steriele 50 ml conische buis. Zachtjes laag 3…

Representative Results

Tussen 10 – 20% van het starten PBMCs differentiëren in dendritische eind van de kweekperiode. Mature DCs zijn CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, en CCR7 + (figuur 1). Ze drukken hoge niveaus van MHC klasse I en II moleculen en co-stimulerende moleculen CD80 en CD86. Poly-ICLC induceerde ook lagere PDL-1 in vergelijking tot andere TLR-agonisten 14. Bovendien, deze Poly-IC-gerijpte DC scheiden grote hoeveelheden IL-12 (figuur 2 en 15,16) en induceren de proliferatie v…

Discussion

Fase I en II klinische proeven van monocyt-afgeleide DCs gebleken dat zij immuunresponsen induceren bij patiënten echter klinisch succes was beperkt 1. Dit kan deels te wijten aan het gebrek aan consensus over hoe de optimale DC's voor tumor immunotherapeutische gebruik genereren. Hoewel er tal van manieren van klinische kwaliteit DCs genereren deze werkwijzen verschillen wat betreft het gebruik van cytokines die de monocyten, stimuli gebruikt om rijping te induceren en werkwijzen antigen loading differe…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs willen graag Andres Salazar (Oncovir, Inc) danken voor de gave van de Poly-ICLC.

Materials

Reagent/Supplies/Equipment Manufacturer Catalog No.
RPMI-1640 medium with L-glutamine BioWhittaker 12-702F
1M HEPES buffered saline BioWhittaker 17-737E
Phosphate buffered saline (PBS) BioWhittaker 17-516F
Human albumin, 25% solution USP Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM GE Healthcare 17-5442-03
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Sterile saline USP Hospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec 170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml Berlex A02266
MACS GMP IL-4 Miltenyi Biotec 170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml Oncovir NA
VACMUNE KLH Biosyn
225 sq cm EasyFlasks Nalgene Nunc 159934
Falcon 6-well tissue culture plates Becton Dickinson 353046
1.8 ml CryoTube vials Nalgene Nunc 377267
Controlled Rate Freezer Thermo CryoMed

References

  1. Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
  2. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
  3. Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
  4. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  5. Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
  6. Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
  7. O’Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
  8. de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
  9. Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
  10. Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
  11. Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
  12. Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
  13. Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
  14. Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
  15. Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
  16. Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
  17. Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
  18. Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
  19. Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
  20. Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
  21. Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
  22. Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
  23. Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
  24. Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).

Play Video

Cite This Article
Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), e50085, doi:10.3791/50085 (2013).

View Video