Summary

הכנת תאים דנדריטים גידול Antigen טעון בוגרים לחיסוניים

Published: August 01, 2013
doi:

Summary

השיטה הנפוצה ביותר להפקת כמויות גדולות של תאים דנדריטים אוטולוגי (DCS) לשימוש באימונותרפיה גידול מתוארת. השיטה משתמשת IL-4 ו-GM-CSF להבדיל מDCs מונוציטים. את DCs הבוסר הוא גירוי לבוגרת ולאחר מכן נטען עם אנטיגנים לפני שהם מוזרקים חזרה לחולה.

Abstract

בעוד שמחקרים קליניים הוכיחו שהחיסונים DC אנטיגן טעונים בטוחים ומבטיחים לטיפול בגידולים 1, היעילות הקלינית שלהם עדיין לא הוקמה. השיטה המתוארת להלן, ערוכה בהתאם לתהליך ייצור טוב (GMP) הנחיות, היא אופטימיזציה של שיטת הכנת vivo לשעבר הנפוצה ביותר ליצירת מספר רב של מחקרים קליניים לDCs 2.

השיטה שלנו מנצלת את TLR הסינטטי 3 אגוניסט carboxymethylcellulose חומצה פולי-L-ליזין Polyinosinic-Polycytidylic (פולי-ICLC) כדי לעורר את DCS. המחקר הקודם שלנו הוקם שפולי-ICLC הוא גירוי התבגרות הפרט החזק ביותר לDCs אדם כפי שהוערך על ידי גברת ביטוי של CD83 וCD86, אינדוקציה של interleukin-12 (IL-12), גורם נמק גידול (TNF), אינטרפרון גאמא-Induced חלבון 10 (IP-10), 1 interleukmin (IL-1), וסוג שהאינטרפרונים (IFN), והמינימאלי אינטרלוקין 10 (IL-10) ייצור. </p>

DCs הם מובחנים מתאי קפואים דם היקפי (mononuclear PBMCs) המתקבלים על ידי leukapheresis. PBMCs מבודד על ידי צנטריפוגה שיפוע Ficoll וקפוא בaliquots. ביום 1, PBMCs הם הפשירו ומצופה על צלוחיות תרבית רקמה כדי לבחור למונוציטים שנצמדים למשטחי הפלסטיק לאחר דגירה 1-2 שעות על 37 מעלות צלזיוס בתרבית רקמת החממה. לאחר דגירה, הלימפוציטים הם לשטוף ומונוציטים חסיד בתרבית במשך 5 ימים בנוכחות של interleukin-4 (IL-4) וגורם מגרה מקרופאג'ים מושבה granulocyte (GM-CSF) כדי לבדל לDCs בשלה. ביום 6, DCS בשלה הם פעמו עם חלבון hemocyanin עלוקת חור המנעול (KLH) המשמש כבקרה לאיכות של החיסון ועלולים להגביר את התגובה החיסונית של החיסון 3. את DCs מומרצים להבשיל, עמוס אנטיגנים פפטיד, וטופחו במשך הלילה. ביום 7, התאים נשטפים, וקפוא ב1 aliquots מ"ל המכיל4 – 20 x 10 6 תאים באמצעות מקפיא מבוקר שיעור. בדיקות שחרורו הרבה לקבוצות של DCs מבוצעת וחייבות לעמוד במפרט מינימאליים לפני שהם מוזרקים לחולים.

Protocol

1. בידוד וCryopreservation של PBMCs 4 הסביבה נקי מחיידקי ספייק אחת מיציאות הגישה בתיק leukapheresis באמצעות מערך העברת פלזמה. באמצעות מזרק 60 מ"ל, להעביר leukapheresis מתקבל מחולים לתוך בקבוק 500 מ"ל סטרילי. …

Representative Results

בין 10 ל – 20% של PBMCs מתחיל להתמיין DCs בסוף תקופת התרבות. DCs בוגרת הן CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 +, וCCR7 + (איור 1). הם מבטאים רמות גבוהות של MHC כיתה אני ומולקולות השנייה ואת מולקולות costimulatory CD80 ו CD86. Poly-ICLC גם מושרה רמות נמוכות יותר של PDL-1, בהשוואה לאגוניסטים TLR האחרים 14. בנוסף, ?…

Discussion

השלב I ו-II של ניסויים קליניים DCs מונוציטים הנגזרות הראו כי הם לעורר תגובות חיסוניות בחולים עם זאת הצלחה קלינית הייתה מוגבלת 1. זה עשוי להיות בחלקו בשל חוסר הסכמה על איך ליצור את DCs האופטימלי לשימוש immunotherapeutic גידול. אמנם יש דרכים רבות כדי ליצור DCs הקליני בדרגה, בשיטו…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות לאנדרס סלזר (Oncovir, Inc) על המתנה של פולי-ICLC.

Materials

Reagent/Supplies/Equipment Manufacturer Catalog No.
RPMI-1640 medium with L-glutamine BioWhittaker 12-702F
1M HEPES buffered saline BioWhittaker 17-737E
Phosphate buffered saline (PBS) BioWhittaker 17-516F
Human albumin, 25% solution USP Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM GE Healthcare 17-5442-03
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Sterile saline USP Hospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec 170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml Berlex A02266
MACS GMP IL-4 Miltenyi Biotec 170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml Oncovir NA
VACMUNE KLH Biosyn
225 sq cm EasyFlasks Nalgene Nunc 159934
Falcon 6-well tissue culture plates Becton Dickinson 353046
1.8 ml CryoTube vials Nalgene Nunc 377267
Controlled Rate Freezer Thermo CryoMed

References

  1. Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
  2. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
  3. Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
  4. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  5. Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
  6. Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
  7. O’Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
  8. de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
  9. Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
  10. Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
  11. Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
  12. Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
  13. Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
  14. Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
  15. Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
  16. Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
  17. Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
  18. Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
  19. Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
  20. Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
  21. Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
  22. Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
  23. Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
  24. Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).

Play Video

Cite This Article
Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), e50085, doi:10.3791/50085 (2013).

View Video