Summary

Подготовка опухолевый антиген нагруженных Зрелые дендритные клетки иммунотерапии

Published: August 01, 2013
doi:

Summary

Наиболее часто используемый способ генерирования большого количества аутологичных дендритных клеток (DC) для использования в иммунотерапии опухолей описано. Метод использует IL-4 и GM-CSF дифференцировать ДК из моноцитов. Незрелые ДК стимулируются, чтобы созреть и затем загружается с антигенами, прежде чем они вводятся обратно в организм пациента.

Abstract

Хотя клинические исследования установили, что антиген-DC загруженных вакцины безопасны и перспективным для терапии опухолей 1, их клиническая эффективность еще предстоит установить. Метод, описанный ниже, подготовленной в соответствии с правилами процесса производства (GMP) руководящие принципы, является оптимизацией самых распространенных бывших естественных условиях подготовки способ генерации большого количества контроллеров домена для клинических исследований 2.

Наши способе используют синтетический агонист TLR 3 Полиинозиновую-полицитидилова кислота-поли-L-лизин-карбоксиметилцеллюлоза (Поли-ICLC), чтобы стимулировать DC. В предыдущем исследовании было установлено, что Poly-ICLC является самым мощным стимулом отдельных созревание для человека РС по оценке регуляция CD83 и CD86, индукции интерлейкина-12 (IL-12), фактор некроза опухолей (ФНО), интерферон гамма-индуцированной белок 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1), интерфероны типа I (IFN) и минимальное интерлейкин-10 (IL-10) производства. </p>

ДК отличаются от замороженных мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС), полученного лейкаферез. РВМС выделяли центрифугированием в градиенте Ficoll и замораживают в аликвотах. В день 1 РВМС оттаивали, засевали на колбах культуры тканей, чтобы выбрать для моноцитов которые прилипают к пластиковой поверхности через 1-2 ч инкубации при 37 ° С в инкубаторе для тканевых культур. После инкубации лимфоцитов смываются и прилипшие моноциты культивировали в течение 5 дней в присутствии интерлейкина-4 (IL-4) и гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) дифференцироваться в незрелые ДК. На 6-й день, незрелые ДК импульсно гемоцианин лимфы улитки (KLH) белок, который служит в качестве контроля качества вакцин и может повысить иммуногенность вакцины 3. ДК стимулируются, чтобы созреть, нагруженных пептидных антигенов, и инкубировали в течение ночи. На 7 день, клетки промывают и замораживают в аликвотах 1 мл, содержащих4 – 20 × 10 6 клеток с использованием контролируемой скорости морозильной камеры. Лот тестирования расцепителя для партий ДК выполняется, и должны соответствовать минимальным требованиям, прежде чем они вводят пациентам.

Protocol

1. Выделение и криоконсервации МНПК 4 Асептически шип одного из портов доступа в лейкафереза ​​сумку с помощью набора переноса плазмы. С помощью 60 мл шприц, передавать лейкафереза, полученных от пациентов в стерильный 500 мл. Регулировка громкости лейкафереза ​​в 2 раз?…

Representative Results

В период с 10 – 20% исходного РВМС дифференцироваться в ДК в конце периода культивирования. Зрелые ДК являются CD11c +, CD14 +, CD83 +, CD40 + и CCR7 + (рис. 1). Они выражают высокие уровни MHC класса I и II молекул и молекул костимулирующую CD80 и CD86. Поли-ICLC также индуцирует более низкие уровни PDL-1 по сра?…

Discussion

Фазы I и II клинических испытаний, полученных из моноцитов ДК показали, что они индуцируют иммунный ответ у пациентов, однако клинический успех был ограничен 1. Частично это может быть связано с отсутствием консенсуса о том, как для формирования оптимального РСУ иммунотерапевтичес…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить Андрес Салазар (Oncovir, Inc) за дар Poly-МКПЦН.

Materials

Reagent/Supplies/Equipment Manufacturer Catalog No.
RPMI-1640 medium with L-glutamine BioWhittaker 12-702F
1M HEPES buffered saline BioWhittaker 17-737E
Phosphate buffered saline (PBS) BioWhittaker 17-516F
Human albumin, 25% solution USP Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM GE Healthcare 17-5442-03
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Sterile saline USP Hospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec 170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml Berlex A02266
MACS GMP IL-4 Miltenyi Biotec 170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml Oncovir NA
VACMUNE KLH Biosyn
225 sq cm EasyFlasks Nalgene Nunc 159934
Falcon 6-well tissue culture plates Becton Dickinson 353046
1.8 ml CryoTube vials Nalgene Nunc 377267
Controlled Rate Freezer Thermo CryoMed

References

  1. Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
  2. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
  3. Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
  4. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  5. Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
  6. Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
  7. O’Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
  8. de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
  9. Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
  10. Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
  11. Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
  12. Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
  13. Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
  14. Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
  15. Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
  16. Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
  17. Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
  18. Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
  19. Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
  20. Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
  21. Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
  22. Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
  23. Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
  24. Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).

Play Video

Cite This Article
Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), e50085, doi:10.3791/50085 (2013).

View Video