Summary

Herstellung von Tumor-Antigen-beladenen reifen dendritischen Zellen für die Immuntherapie

Published: August 01, 2013
doi:

Summary

Das am häufigsten verwendete Verfahren zum Erzeugen einer großen Anzahl von autologen dendritischen Zellen (DCs) zur Verwendung bei Tumor-Immuntherapie beschrieben. Das Verfahren nutzt IL-4 und GM-CSF zu DCs aus Monozyten differenzieren. Die unreifen DCs sind, um zu reifen und dann mit Antigenen beladen stimuliert, bevor sie zurück in den Patienten injiziert werden.

Abstract

Obwohl klinische Studien festgestellt haben, dass Antigen-beladenen DC Impfstoffe sicher und viel versprechende Therapie für Tumore 1 sind, bleibt ihre klinische Wirksamkeit festgelegt werden. Das nachfolgend beschriebene Verfahren, hergestellt gemäß Good Manufacturing-Verfahren (GMP)-Richtlinien, ist eine Optimierung der häufigste ex vivo Herstellungsverfahren zur Erzeugung einer großen Anzahl von DCs für klinische Studien 2.

Unsere Methode nutzt die synthetischen TLR-Agonisten Polyinosin 3-Polycytidylsäure-Poly-L-Lysin Carboxymethylcellulose (Poly-ICLC), um die DCs zu stimulieren. Unsere früheren Studie festgestellt, dass Poly-ICLC die stärkste einzelne Reifung Stimulus für den menschlichen DCs ist, wie durch eine Hochregulation von CD83 und CD86, Induktion von Interleukin-12 (IL-12), Tumor-Nekrose-Faktor (TNF), Interferon-gamma-induzierten beurteilt Protein 10 (IP-10), interleukmin 1 (IL-1) und Typ-I-Interferonen (IFN) und minimal Interleukin 10 (IL-10) Produktion. </p>

DCs sind aus gefrorenem peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) von Leukapherese erhalten differenziert. PBMCs durch Ficollgradientenzentrifugation isoliert und in Aliquots eingefroren. Am Tag 1 werden PBMCs aufgetaut und überzogen auf Gewebekulturflaschen für Monozyten, die auf der Kunststoffoberfläche nach 1-2 h Inkubation bei 37 ° C in der Gewebekulturinkubator haften wählen. Nach der Inkubation werden die Lymphozyten durch Waschen entfernt und die anhaftenden Monozyten werden für 5 Tage in Gegenwart von Interleukin-4 (IL-4) und Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF) zu unreifen DC differenzieren kultiviert. Am Tag 6 werden unreife DCs mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH)-Protein, das als eine Kontrolle für die Qualität der Impfstoff dient und die Immunogenität der Impfstoff 3 steigern gepulst. Die DCs stimuliert werden, um zu reifen, beladen mit Peptid-Antigene, und über Nacht inkubiert. Am 7. Tag wurden die Zellen gewaschen und in 1 ml eingefroren Aliquots, welche4 – 20 x 10 6 Zellen mit einer kontrollierten Rate Gefrierschrank. Lot Release-Tests für die Chargen von DCs durchgeführt und müssen Mindestanforderungen erfüllen, bevor sie in die Patienten injiziert werden.

Protocol

1. Isolation und Kryokonservierung von PBMCs 4 Aseptisch Spike einer der Access-Ports in der Leukapherese Tasche mit einem Plasma-Transfer-Set. Mit einem 60-ml-Spritze, übertragen Sie die Leukapherese von Patienten in eine sterile 500 ml-Flasche erhältlich. Stellen Sie die Lautstärke des Leukapherese auf sein ursprüngliches Volumen mit Raumtemperatur RPMI 2x. Gründlich mischen. Vorsichtig mischen die Flasche Ficoll-Paque PLUS. In 12 ml Ficoll-Paque PLUS in sterile 50 ml kon…

Representative Results

Zwischen 10 – 20% Ausgangsmaterial PBMCs differenzieren in DCs am Ende der Kulturperiode. Reife DCs sind CD11c +, CD14-, CD83 +, CD40 + und CCR7 + (Abbildung 1). Sie exprimieren hohe Mengen von MHC-Klasse-I und-II-Molekülen und den kostimulatorischen Moleküle CD80 und CD86. Poly-ICLC auch unteren Ebenen der PDL-1 induziert zu anderen TLR-Agonisten 14 verglichen. Darüber hinaus führen diese Poly-IC-gereiften DCs sezernieren große Mengen an IL-12 (Abbildung 2 und 15,1…

Discussion

Phase-I-und-II-Studien von Monozyten-abgeleiteten DCs haben gezeigt, dass sie Immunreaktionen induzieren in Patienten jedoch klinische Erfolg wurde 1 beschränkt. Dies kann zum Teil auf den Mangel an Konsens darüber, wie die optimalen DCs für die Tumor-Immuntherapie Verwendung erzeugen. Obwohl es zahlreiche Möglichkeiten, um klinische Studien zu DCs zu erzeugen, unterscheiden sich diese Verfahren im Hinblick auf die Verwendung von Zytokinen, die Monozyten, Stimuli, um die Reifung zu induzieren, und die Met…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren bedanken sich bei Andres Salazar (Oncovir, Inc.) für das Geschenk des Poly-ICLC danken.

Materials

Reagent/Supplies/Equipment Manufacturer Catalog No.
RPMI-1640 medium with L-glutamine BioWhittaker 12-702F
1M HEPES buffered saline BioWhittaker 17-737E
Phosphate buffered saline (PBS) BioWhittaker 17-516F
Human albumin, 25% solution USP Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM GE Healthcare 17-5442-03
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Sterile saline USP Hospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec 170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml Berlex A02266
MACS GMP IL-4 Miltenyi Biotec 170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml Oncovir NA
VACMUNE KLH Biosyn
225 sq cm EasyFlasks Nalgene Nunc 159934
Falcon 6-well tissue culture plates Becton Dickinson 353046
1.8 ml CryoTube vials Nalgene Nunc 377267
Controlled Rate Freezer Thermo CryoMed

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Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), e50085, doi:10.3791/50085 (2013).

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