Summary

إعداد ورم مستضد محملة الخلايا الجذعية الناضجة لعلاج مناعي

Published: August 01, 2013
doi:

Summary

يوصف الأسلوب الأكثر استخداما لتوليد أعداد كبيرة من الخلايا الجذعية ذاتي (DCS) لاستخدامها في العلاج بالخلايا الجذعية السرطانية. يستخدم الأسلوب IL-4 و GM-CSF للتمييز البلدان النامية من حيدات. يتم تحفيز البلدان النامية غير ناضجة لتنضج ومن ثم تحميلها مع مستضدات قبل أن يتم حقنها مرة أخرى في جسم المريض.

Abstract

بينما أثبتت الدراسات السريرية أن اللقاحات DC مستضد محملة آمنة والعلاج واعدة للأورام يبقى فعاليتها السريرية التي ستنشأ. الطريقة الموضحة أدناه، التي أعدت وفقا للإجراءات التصنيع الجيدة (GMP) المبادئ التوجيهية، هو تعظيم الاستفادة من طريقة إعداد فيفو السابقين الأكثر شيوعا لتوليد أعداد كبيرة من البلدان النامية للدراسات السريرية 2.

لدينا وسيلة تستخدم TLR الاصطناعية 3 ناهض Polyinosinic-Polycytidylic ميثيل السيلولوز حمض بولي-L-يسين (بولي ICLC) لتحفيز البلدان النامية. أنشئت لدينا دراسة سابقة أن بولي ICLC هو أقوى التحفيز نضوج الفرد بالنسبة للبلدان النامية الإنسان وفقا لتقييم زيادة إفراز من CD83 CD86 و، تحريض انترلوكين 12 (IL-12)، عامل نخر الورم (TNF)، انترفيرون غاما الناجمة عن بروتين 10 (IP-10)، interleukmin 1 (IL-1)، والنوع الأول إنترفيرون (الإنترفيرون)، والحد الأدنى من انترلوكين 10 (IL-10) الإنتاج. </p>

يتم التمييز البلدان النامية من خلايا وحيدات النوى المجمدة الدم المحيطي (PBMCs) التي حصلت عليها فصادة الكريات البيض. يتم عزل PBMCs بواسطة الطرد المركزي المتدرج Ficoll والمجمدة في مأخوذة. في يوم 1، ويتم إذابة PBMCs ومطلي على قوارير زراعة الأنسجة لتحديد لحيدات التي تلتزم سطح البلاستيك بعد 1-2 ساعة الحضانة عند 37 درجة مئوية في نسيج الثقافة الحاضنة. بعد الحضانة، ويتم غسل الخلايا الليمفاوية قبالة ويتم تربيتها وحيدات ملتصقة لمدة 5 أيام في وجود انترلوكين 4 (IL-4) ومحببة عامل تحفيز مستعمرة البلاعم (GM-CSF) للتمييز إلى البلدان النامية غير ناضجة. في يوم 6، ونابض البلدان النامية غير ناضجة مع البطلينوس هيموسيانين (KLH) بروتين ثقب المفتاح التي هي بمثابة مراقبة لجودة اللقاح، وربما تعزيز المناعية للقاح 3. يتم تحفيز البلدان النامية إلى أن تنضج، محملة مستضدات الببتيد، وحضنت بين عشية وضحاها. في يوم 7، يتم غسلها الخلايا، وجمدت في 1 مليلتر مأخوذة تحتوي على4-20 × 10 6 خلايا باستخدام المجمد سعر للرقابة. يتم تنفيذ الكثير الإفراج اختبار للدفعات من البلدان النامية ويجب أن تستوفي الحد الأدنى من المواصفات قبل أن يتم حقنها في المرضى.

Protocol

1. العزلة والحفظ بالتبريد من PBMCs 4 جو معقم و مطهر سنبلة واحدة من منافذ الوصول في كيس فصادة الكريات البيض باستخدام مجموعة نقل البلازما. باستخدام 60 مل حقنة، ونقل فصادة الكريات البيض التي تم الحصول عليها من المرضى إل?…

Representative Results

ما بين 10 – 20٪ من PBMCs بدءا تفرق في البلدان النامية في نهاية فترة التربية. البلدان النامية الناضجة هي CD11c و+، CD14، CD83 +، CD40 +، وCCR7 + (الشكل 1). وهم يعربون عن مستويات عالية من فئة MHC الأول والثاني جزيئات والجزيئات costimulatory CD80 CD86 و. أيضا بفعل بولي ICLC مستويات أقل من PDL-1 بالمق?…

Discussion

المرحلة الأولى والثانية وقد أظهرت التجارب السريرية من DCS الوحيدات المستمدة أنها تحفز الاستجابات المناعية في المرضى لكن النجاح كان محدودا السريرية 1. قد يكون هذا يرجع جزئيا إلى عدم وجود توافق في الآراء بشأن كيفية توليد البلدان النامية الأمثل للاستخدام immunotherapeuti…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

فإن الكتاب أود أن أشكر اندريس سالازار (Oncovir، وشركة) للهدية من بولي ICLC.

Materials

Reagent/Supplies/Equipment Manufacturer Catalog No.
RPMI-1640 medium with L-glutamine BioWhittaker 12-702F
1M HEPES buffered saline BioWhittaker 17-737E
Phosphate buffered saline (PBS) BioWhittaker 17-516F
Human albumin, 25% solution USP Aventis Behring
Ficoll-Hypaque PREMIUM GE Healthcare 17-5442-03
Human AB serum Valley Biomedical HP1022
Sterile saline USP Hospira
CryoMACS DMSO Miltenyi Biotec 170-076-303
Leukine GM-CSF, 0.5 mg/ml Berlex A02266
MACS GMP IL-4 Miltenyi Biotec 170-076-101
Hiltonol, Poly-ICLC, 2 mg/ml Oncovir NA
VACMUNE KLH Biosyn
225 sq cm EasyFlasks Nalgene Nunc 159934
Falcon 6-well tissue culture plates Becton Dickinson 353046
1.8 ml CryoTube vials Nalgene Nunc 377267
Controlled Rate Freezer Thermo CryoMed

References

  1. Lesterhuis, W. J., et al. Dendritic cell vaccines in melanoma: from promise to proof. Crit. Rev. Oncol. Hematol. 66, 118-134 (2008).
  2. Sabado, R. L., Bhardwaj, N. Directing dendritic cell immunotherapy towards successful cancer treatment. Immunotherapy. 2, 37-56 (2010).
  3. Schumacher, K. Keyhole limpet hemocyanin (KLH) conjugate vaccines as novel therapeutic tools in malignant disorders. J. Cancer. Res. Clin. Oncol. 127, 1-2 (2001).
  4. Jaatinen, T., Laine, J. Isolation of mononuclear cells from human cord blood by Ficoll-Paque density gradient. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. Chapter 2, Unit 2A 1 (2007).
  5. Eichler, H., et al. Multicenter study on in vitro characterization of dendritic cells. Cytotherapy. 10, 21-29 (2008).
  6. Feuerstein, B., et al. A method for the production of cryopreserved aliquots of antigen-preloaded, mature dendritic cells ready for clinical use. J. Immunol. Methods. 245, 15-29 (2000).
  7. O’Neill, D., Bhardwaj, N. Generation of autologous peptide- and protein-pulsed dendritic cells for patient-specific immunotherapy. Methods Mol. Med. 109, 97-112 (2005).
  8. de Vries, I. J., et al. Phenotypical and functional characterization of clinical grade dendritic cells. J. Immunother. 25, 429-438 (2002).
  9. Jonuleit, H., et al. Pro-inflammatory cytokines and prostaglandins induce maturation of potent immunostimulatory dendritic cells under fetal calf serum-free conditions. Eur. J. Immunol. 27, 3135-3142 (1997).
  10. Lee, A. W., et al. A clinical grade cocktail of cytokines and PGE2 results in uniform maturation of human monocyte-derived dendritic cells: implications for immunotherapy. Vaccine. 20, A8-A22 (2002).
  11. Bhardwaj, N. Harnessing the immune system to treat cancer. J. Clin. Invest. 117, 1130-1136 (2007).
  12. Gnjatic, S., Sawhney, N. B., Bhardwaj, N. Toll-like receptor agonists: are they good adjuvants?. Cancer J. 16, 382-391 (2010).
  13. Kedl, R. M., Kappler, J. W., Marrack, P. Epitope dominance, competition and T cell affinity maturation. Curr. Opin. Immunol. 15, 120-127 (2003).
  14. Bogunovic, D., et al. TLR4 engagement during TLR3-induced proinflammatory signaling in dendritic cells promotes IL-10-mediated suppression of antitumor immunity. Cancer Research. 71, 5467-5476 (2011).
  15. Verdijk, R. M., et al. Polyriboinosinic polyribocytidylic acid (poly(I:C)) induces stable maturation of functionally active human dendritic cells. J. Immunol. 163, 57-61 (1999).
  16. Rouas, R., et al. Poly(I:C) used for human dendritic cell maturation preserves their ability to secondarily secrete bioactive IL-12. Int. Immunol. 16, 767-773 (2004).
  17. Jongmans, W., Tiemessen, D. M., van Vlodrop, I. J., Mulders, P. F., Oosterwijk, E. Th1-polarizing capacity of clinical-grade dendritic cells is triggered by Ribomunyl but is compromised by PGE2: the importance of maturation cocktails. J. Immunother. 28, 480-487 (2005).
  18. Krause, P., et al. Prostaglandin E2 is a key factor for monocyte-derived dendritic cell maturation: enhanced T cell stimulatory capacity despite IDO. J. Leukoc. Biol. 82, 1106-1114 (2007).
  19. Morelli, A. E., Thomson, A. W. Dendritic cells under the spell of prostaglandins. Trends Immunol. 24, 108-111 (2003).
  20. Adams, M., et al. Dendritic cell (DC) based therapy for cervical cancer: use of DC pulsed with tumour lysate and matured with a novel synthetic clinically non-toxic double stranded RNA analogue poly [I]:poly [C(12)U] (Ampligen R). Vaccine. 21 (12), 787-790 (2003).
  21. Colombo, M. P., Trinchieri, G. Interleukin-12 in anti-tumor immunity and immunotherapy. Cytokine Growth Factor Rev. 13, 155-168 (2002).
  22. Mayordomo, J. I., et al. Bone marrow-derived dendritic cells pulsed with synthetic tumour peptides elicit protective and therapeutic antitumour immunity. Nat Med. 1, 1297-1302 (1995).
  23. Dhodapkar, M. V., et al. Rapid generation of broad T-cell immunity in humans after a single injection of mature dendritic cells. J. Clin. Invest. 104, 173-180 (1999).
  24. Schuler-Thurner, B., et al. Rapid induction of tumor-specific type 1 T helper cells in metastatic melanoma patients by vaccination with mature, cryopreserved, peptide-loaded monocyte-derived dendritic cells. J. Exp. Med. 195, 1279-1288 (2002).

Play Video

Cite This Article
Sabado, R. L., Miller, E., Spadaccia, M., Vengco, I., Hasan, F., Bhardwaj, N. Preparation of Tumor Antigen-loaded Mature Dendritic Cells for Immunotherapy. J. Vis. Exp. (78), e50085, doi:10.3791/50085 (2013).

View Video