Este método descreve como isolar e imortalizar células endoteliais microvasculares de cérebro de rato. Descreve-se um protocolo de passo-a-passo a partir da homogeneização do tecido cerebral, as etapas de digestão, a semeadura e imortalização das células. Normalmente, leva cerca de cinco semanas, para se obter uma homogeneidade, linha celular imortalizada microvascular endotelial.
As células epiteliais e endoteliais (CE) são a construção de barreiras paracelular que protegem o tecido a partir do ambiente externo e interno. A barreira hemato-encefálica (BHE), constituído por CE, astrócitos finais pés, pericitos e a membrana basal é responsável pela protecção e homeostase do parênquima cerebral. Modelos in vitro BBB são ferramentas comuns para o estudo da estrutura e função da BHE a nível celular. Um número considerável de diferentes modelos in vitro BBB foram estabelecidos por pesquisa em diferentes laboratórios até à data. Normalmente, as células são obtidas a partir de bovinos, suínos, rato ou ratinho tecido cerebral (discutido em detalhe na revisão por Wilhelm et al. 1). Amostras de tecido humano estão disponíveis apenas em um número restrito de laboratórios ou empresas 2,3. Embora as preparações de células primárias são demorados e as culturas de EC pode variar de lote para lote, o estabelecimento de imortalizada CE lines é o foco de interesse científico.
Aqui, apresentamos um método para estabelecer um imortalizado cérebro microvascular linha CE do cérebro de rato neonatal. Descreve-se o procedimento de listagem passo-a-passo a reagentes e soluções utilizados. O método estabelecido pelo nosso laboratório permite o isolamento de uma linha celular imortalizada endotelial homogénea dentro de 4-5 semanas. As linhas de células cerebrais microvasculares endoteliais denominado CEND 4 (a partir de córtex cerebral) e cerebEND 5 (a partir de córtex cerebelar), foram isolados de acordo com este procedimento no laboratório Förster e têm sido eficazmente utilizados para explicação de diversos processos fisiológicos e patológicos no BBB. Usando CEND cerebEND e demonstrámos que as células respondem a glucocorticóides 4,6-9 e estrogénio-tratamento 10, bem como a pró-infammatory mediadores, tais como TNFalfa 5,8. Além disso, estudou-se a patologia de múltiplas sclerosis 11 e hipóxia 12,13 na CE-nível. O CEND e linhas cerebEND pode ser considerado como uma boa ferramenta para o estudo da estrutura e função das respostas celulares, BBB de ECs a diferentes estímulos ou interacção da CE com linfócitos ou células cancerosas.
O processo descrito pode ser utilizado para o isolamento de microvascular CEs a partir de diferentes estirpes de ratinho, bem como a partir de diferentes estirpes de ratinho knock-out para estudar as alterações específicas na função do endotélio vascular. Como um método de imortalização utilizou-se a transformação com oncoproteína de poliomavírus murino, Polioma meio antigénio T. Ele transforma rapidamente imaturos células endoteliais in vivo e in vitro 20,21,22. Outros métodos de imortalização das células endoteliais descritos na literatura incluem, por exemplo, a imortalização com antigénio T grande de SV40 do Simian Virus vacuolar 40 23, o produto do gene E1A do adenovírus 24 ou sobre-expressão da subunidade catalítica da telomerase humana 3. A imortalização com PymT é específico para a ECs murino imaturo, que permite a obtenção de uma cultura CE homogénea a partir de ratinhos neonatais em curto espaço de tempo. Imortalização altera as propriedades das células e poos resultados obtidos com os e linhas celulares imortalizadas, deve ser comparada com as células primárias ou com as experiências in vivo com ratinhos. PymT CE imortalizada foi descrito para expressar níveis elevados de actividade fibrinolítica resultantes de aumento da produção de activador do plasminogénio tipo urocinase-e diminuição da produção de activador do plasminogénio inibidores 25. A comparação directa de PymT bEND5 linha celular imortalizada com primário CEs revelou que tanto em modelos in vitro BBB são adequados para estudos de adesão de células T 26.
As linhas celulares estabelecidas de acordo com o processo descrito pode ser utilizado no número de passagem baixa para manter as propriedades de barreira pela expressão elevada de BBB e CE proteínas juncionais, como as células perdem estas propriedades durante o envelhecimento. Assim, após a perda de propriedades de barreira, a preparação de uma nova linha de células deve ser considerada. Densidade de plaqueamento de células deve ser elevada para os ECs, como este é crítica para a proliferação de células. Isto deve ser considerado durante o processo de isolamento, bem como a manutenção do ECs imortalizado. Cada linha de células de novo deve ser testada para as suas propriedades de barreira e de possíveis contaminantes, com outros tipos de células. Monocamadas EC podem ser coradas com anti-antigénio músculo galactocerebrósido, anti-glial fibrilar ácida e proteína anti-liso como anticorpos primários para excluir a contaminação com oligodendrócitos, astrócitos e pericitos 4,27. Para impedir a contaminação pela vasculatura meningal, a expressão da trombomodulina pode ser testado, o que é expresso em todos os leitos vasculares com a excepção do cérebro 28.
Curiosamente, as linhas celulares imortalizadas microvasculares endoteliais isoladas de diferentes regiões do cérebro diferem nas suas propriedades de barreira e de susceptibilidade a estímulos pró-inflamatórios. Como um exemplo, as linhas de células cerebrais e cerebelares CEND cerebEND podem ser mencionados 4,5. CerebEND mostrou, em comparaçãopara CEND, menores níveis de expressão dos principais componentes da junção apertadas claudina-1 e occludin. No entanto, os níveis de claudina-3 e -12 foram maiores no cerebEND. A função da barreira de células cerebEND sofreu muito mais sob o tratamento com o mediador inflamatório, TNFa do que as propriedades de barreira de células CEND fez 5. Vulnerabilidade cerebelar superior a estímulos inflamatórios, podem ser observados in vivo em doentes com esclerose múltipla e na sua experimental do modelo animal, a encefalomielite auto-imune 29. Estes resultados interessantes mostrar a necessidade de gerar e caracterizar indivíduo em modelos in vitro de diferentes regiões do cérebro, de modo a melhorar o direccionamento da droga futuro para o cérebro.
The authors have nothing to disclose.
Esta pesquisa foi apoiada pelo Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG sob o número concessão FO 315/4-1 e SFB DFG 688.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |