هذه الطريقة يصف كيفية عزل خلايا بطانية وخلد الاوعية الدموية الدقيقة من مخ الفأر. وصفنا بروتوكول خطوة بخطوة بدءا من تجانس أنسجة المخ، والخطوات الهضم، والبذر وتخليد للخلايا. عادة، يستغرق حوالي خمسة أسابيع للحصول على متجانسة، خلدت الاوعية الدموية الدقيقة خط الخلية البطانية.
الخلايا الظهارية والبطانية (EC) وبناء الحواجز التي تحمي paracellular الأنسجة من البيئة الخارجية والداخلية. حاجز الدم في الدماغ (BBB)، ويتألف من EC، نجمية نهاية أقدام pericytes، والغشاء القاعدي هو المسؤول عن الحماية والتوازن للحمة الدماغ. في المختبر هي نماذج BBB الأدوات المشتركة لدراسة بنية ووظيفة BBB على المستوى الخلوي. وقد تم إنشاء عدد كبير من مختلف النماذج في المختبر BBB للبحوث في مختبرات مختلفة حتى الآن. عادة، يتم الحصول على الخلايا من الأبقار، الخنازير، الفئران أو الماوس أنسجة المخ (نوقشت بالتفصيل في الاستعراض الذي فيلهلم وآخرون. 1). عينات الأنسجة البشرية لا تتوفر إلا في عدد محدود من المختبرات أو الشركات 2،3. بينما الخلية الأولية هي الاستعدادات تستغرق وقتا طويلا ويمكن أن تختلف الثقافات EC من دفعة لدفعة، وإنشاء خلد EC لينES هو محور الاهتمام العلمي.
هنا، نقدم طريقة لإنشاء خط خلد الدماغ EC الاوعية الدموية الدقيقة من مخ الفأر حديثي الولادة. وصفنا الإجراء خطوة بخطوة قائمة الكواشف والحلول المستخدمة. وبالطريقة المحددة من قبل المختبر يسمح للعزلة ومتجانسة خلد خط الخلية البطانية في غضون أربعة إلى خمسة أسابيع. الاوعية الدموية الدقيقة في الدماغ خطوط الخلايا البطانية ووصف cEND 4 (من القشرة المخية) وcerebEND 5 (القشرة المخيخية من)، تم عزل وفقا لهذا الإجراء في المختبر فورستر واستخدمت على نحو فعال لشرح مختلف العمليات الفسيولوجية والمرضية في BBB. وباستخدام cEND cerebEND لقد أثبتنا أن هذه الخلايا تستجيب ل4،6-9-جلايكورتيكود والاستروجين علاج 10 كما كذلك لصالح infammatory سطاء، مثل TNFalpha 5،8. وعلاوة على ذلك، درسنا في علم الأمراض من SC متعددةlerosis 11 و 12،13 نقص الأكسجة على مستوى EC-. يمكن اعتبار cEND وخطوط cerebEND كأداة جيدة لدراسة بنية ووظيفة الردود وBBB الخلوية من ECS للمؤثرات مختلفة أو تفاعل مع الخلايا اللمفية أو EC الخلايا السرطانية.
ويمكن استخدام الإجراء الموضح لعزل سلالات من الاوعية الدموية الدقيقة ECS الماوس المختلفة وكذلك من مختلف سلالات الفئران ضرب المغادرة لدراسة التغيرات في وظيفة محددة البطانة الوعائية. كوسيلة من وسائل تخليد استخدمنا التحول مع oncoprotein من الفيروسة التورامية الفئران، تورام المستضد T الأوسط. فإنها تحول بسرعة الخلايا البطانية غير ناضجة في الجسم الحي في المختبر و20،21،22. وسائل أخرى للتخليد ECS هو موضح في الأدب تشمل على سبيل المثال تخليد مع المستضد T SV40 كبيرة من الفيروس قردي 40 23 المفجي، منتج الجين اتش E1A 24 أو overexpression من الوحيدات الحفاز تيلوميراز الإنسان 3. تخليد مع PymT هو محددة لاظهار الدعم للالفئران غير ناضجة، والذي يسمح الحصول على ثقافة متجانسة من الفئران EC حديثي الولادة في وقت قصير. تخليد تغيير خصائص الخلايا واليجب مقارنة نتائج ه تم الحصول عليها مع خطوط الخلايا خلد سواء مع الخلايا الأولية أو مع التجارب المجراة على الفئران. وقد وصفت PymT EC خلدت للتعبير عن مستويات عالية من النشاط fibrinolytic والناتجة عن زيادة إنتاج المنشط البلازمينوجين يوروكيناز من نوع وانخفض إنتاج مثبطات منشط البلازمينوجين 25. المقارنة المباشرة لPymT خلد bEND5 خط الخلية الأولية مع ECS كشفت أن كلا من النماذج في المختبر BBB هي مناسبة تماما للدراسات التصاق الخلايا T 26.
يمكن استخدام خطوط الخلايا التي أنشئت وفقا للإجراء المبين في رقم مرور منخفضة للحفاظ على خصائص الحاجز بواسطة التعبير عالية من البروتينات وBBB EC موصلي، كما تفقد الخلايا هذه الخصائص خلال الشيخوخة. هكذا بعد فقدان خصائص الحاجز، ينبغي النظر في إعداد خط خلية جديدة. يجب أن تكون الخلية كثافة الطلاء عالية لاظهار الدعم، وهذا أمر بالغ الأهمية لانتشار الخلايا. يجب النظر في هذا الإجراء خلال العزلة وكذلك الحفاظ على ECS خلد. وينبغي اختبار كل سطر الخلية الجديدة لخصائص الجدار وللملوثات محتملة مع أنواع الخلايا الأخرى. يمكن ملطخة monolayers EC مع مستضد العضلات المضادة للغالاكتوسيريبروزيد والبروتين لييفي الحمضية المضادة للالدبقية ومكافحة سلس والأجسام المضادة الأولية لاستبعاد التلوث مع الخلايا النجمية، وoligodendrocytes قد pericytes 4،27. استبعاد التلوث الأوعية الدموية meningal، يمكن اختبار التعبير عن thrombomodulin، وهو ما يعبر عنه في كل أسرة الأوعية الدموية باستثناء الدماغ 28.
ومن المثير للاهتمام، وخلد خطوط الخلايا البطانية الاوعية الدموية الدقيقة المعزولة من مناطق الدماغ المختلفة تختلف في خصائص الجدار والتعرض للمؤثرات الموالية للالتهابات. وكمثال على ذلك، يمكن ذكر الدماغي خلية cerebEND cEND والمخيخ خطوط 4،5. وأظهرت CerebEND، مقارنةلcEND، وانخفاض مستويات التعبير عن مكونات رئيسية تقاطع ضيق claudin-1 وoccludin. ومع ذلك، كانت مستويات claudin-3 -12 وأعلى في cerebEND. عانى وظيفة الحاجز من الخلايا cerebEND أكثر من ذلك بكثير تحت العلاج مع الوسيط التهابات، TNFα من خصائص الجدار من الخلايا cEND فعلت 5. ويمكن ملاحظة ضعف أعلى المخيخ للمؤثرات التهابات، في الجسم الحي في مرضى التصلب المتعدد ولها في حيوانات التجارب الذاتية التهاب الدماغ و النخاع نموذج 29. هذه النتائج مثيرة للاهتمام تظهر ضرورة توليد وتميز الفرد نماذج في المختبر لمناطق الدماغ المختلفة، من أجل تحسين استهداف المستقبل المخدرات في الدماغ.
The authors have nothing to disclose.
وأيد هذا البحث من قبل جمعية الألمانية للبحوث DFG تحت رقم FO منحة 315/4-1 وDFG SFB 688.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |