שיטה זו מתארת כיצד לבודד ולהנציח תאי אנדותל כלי דם ממוח עכבר. אנו מתארים פרוטוקול צעד אחר צעד החל מהומוגניזציה של רקמת מוח, שלבי עיכול, זריעה והנצחה של התאים. בדרך כלל, זה לוקח בערך חמישה שבועות כדי להשיג קו אחיד, שהונצח כלי דם האנדותל תא.
תאי אפיתל ואנדותל (EC) בונים מחסומי paracellular אשר להגן על הרקמות מהסביבה החיצונית והפנימית. מחסום דם המוח (BBB) בהיקף של EC, בסוף הרגליים, pericytes astrocyte וקרום הבסיס הוא אחראי להגנה והאיזון של parenchyma המוח. במודלים חוץ גופיית BBB הם כלים משותפים ללימוד המבנה והתפקוד של BBB ברמה התאית. מספר לא מבוטל של דגמים שונים במבחנת BBB הוקם במשך מחקר במעבדות שונות עד היום. בדרך כלל, את התאים מתקבלים ממקור הבקר, חזיר, עכברוש רקמת מוח או עכבר (נדון בהרחבה בביקורת על ידי וילהלם et al. 1). דגימות רקמה אנושיות הן זמינות רק במספר מצומצם של מעבדות או חברות 2,3. בעוד הכנות ראשוניות של תא הן זמן רבים ותרבויות EC יכולות להיות שונות מיצווה כדי תצווה, ההקמה הונצחה EC ליןes הוא מוקד העניין מדעי.
כאן, אנו מציגים שיטה לקביעת קו הונצח מוח כלי דם EC ממוח עכבר ילוד. אנו מתארים את רישום צעד אחר צעד הליך ריאגנטים ופתרונות בשימוש. השיטה שהוקמה על ידי המעבדה שלנו מאפשרת בידוד של קו הומוגני הונצח אנדותל תא בתוך ארבעה עד חמישה שבועות. שורות תאי אנדותל כלי הדם במוח המכונות cEND 4 (מקליפת מוח) וcerebEND 5 (מקליפת המוח הקטנה), היינו מבודדים על פי נוהל זה במעבדת פורסטר ויש יעילות בשימוש להסבר של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים שונים בב"ב. שימוש cEND וcerebEND אנו מראים כי תאים אלה מגיבים לglucocorticoid-4,6-9 ואסטרוגן טיפול 10, כמו גם למתווכים פרו infammatory, כגון TNFalpha 5,8. יתר על כן, יש לנו למדנו את הפתולוגיה של מרובה sc11 lerosis והיפוקסיה 12,13 ב EC ברמה. CEND וקווי cerebEND יכולים להיחשב ככלי טוב ללימוד המבנה והתפקוד של BBB תגובות, הסלולריות של ECs לגירויים או באינטראקציה שונים של EC עם ימפוציטים או תאים סרטניים.
ההליך המתואר יכול לשמש לבידוד של כלי הדם ECS מזנים שונים של עכברים, כמו גם מזנים שונים עקום החוצה עכברים כדי ללמוד את השינויים הספציפיים בתפקוד האנדותל בכלי דם. כדרך להנצחה הייתי שינוי עם oncoprotein של polyomavirus העכברי, אנטיגן T Polyoma האמצע. זה הופך את תאי האנדותל בשלה במהירות in vivo ו במבחנה 20,21,22. שיטות אחרות להנצחה של ECs תוארו בספרות כוללות למשל הנצחה עם האנטיגן SV40 גדול T של וירוס Vacuolating קופי 40 23, גן מוצר אדנווירוס 24 E1A או ביטוי יתר של המקטע הקטליטית של telomerase האנושי 3. ההנצחה עם PymT היא ספציפית לECs הבוסר העכברי, המאפשר קבלת תרבות EC הומוגנית מעכברים ילודים בזמן קצר. הנצחה משנה את התכונות של התאים והתוצאות שהושגו עם דואר שורות תאים הנציחו יש להשוות גם עם תאים ראשוניים או בניסויי in vivo בעכברים. PymT EC הונצח תואר להביע רמות גבוהות של פעילות fibrinolytic הנובעות מייצור מוגבר של urokinase סוג plasminogen activator וירידה בייצור של plasminogen activator 25 מעכבים. השוואה ישירה של PymT הונצחה קו bEND5 תא עם ECS הראשונית עלה, כי הן במודלים חוץ גופיית BBB מתאימים גם ללימודי הידבקות תא T 26.
שורות התאים הוקמו בהתאם לנוהל שתואר ניתן להשתמש במספר מעבר נמוך כדי לשמור על נכסי מכשול על ידי ביטוי גבוה של חלבוני junctional BBB ו-EC, כמו תאים מאבדים מאפיינים אלה במהלך ההזדקנות. לכן לאחר אובדן נכסי מכשול, ההכנה של שורת תאים חדשה צריכה להיחשב. צפיפות תאי ציפוי צריכה להיות גבוהה לECs, כמו זו היא קריטית לשגשוג תאים. זה יש לבחון במהלך הליך הבידוד, כמו גם תחזוקה של ECs הונצח. כל שורת תאים חדשה צריכה להיבדק על נכסי המכשול ולמזהמים אפשריים עם סוגי תאים אחרים. monolayers EC ניתן מוכתם בחומץ חלבון אנטי galactocerebroside, אנטי גליה fibrillary ואנטי חלק אנטיגן שרירים כמו נוגדנים ראשוניים שלא לכלול את הזיהום עם oligodendrocytes, האסטרוציטים וpericytes 4,27. כדי לשלול זיהום על ידי מערכת כלי דם meningal, הביטוי של thrombomodulin ניתן לבדוק, שבא לידי ביטוי בכל ערוצי כלי הדם, למעט המוח 28.
מעניין, את הקווים הנציחו כלי דם אנדותל התאים שאזורי מוח שונים נבדלים בתכונות וגם ברגישות שלהם לגירויי המכשול פרו דלקתיים. כדוגמה, שורות תאי המוח והמוח קטן cEND cerebEND ניתן לציין 4,5. CerebEND הראה, בהשוואהלcEND, רמות ביטוי נמוכות יותר של רכיבי צומת ההדוקים העיקריים claudin-1 וoccludin. עם זאת, ברמות של claudin-3 ו -12 היו גבוהות יותר בcerebEND. תפקוד המחסום של תאי cerebEND סבל הרבה יותר תחת טיפול עם המתווך הדלקתי, TNFα ממאפייני המכשול של תאי cEND עשו 5. פגיעות מוח קטנות יותר לגירויים דלקתיים, ניתן להבחין בחי בחולי טרשת נפוצה ובניסיוני מודל החיה שלה אוטואימונית Encephalomyelitis 29. ממצאים מעניינים אלה עולים הצורך ביצירה ואפיון פרטני במודלים חוץ גופייה לאזורים שונים של מוח, על מנת לשפר את תרופת עתיד מיקוד לתוך המוח.
The authors have nothing to disclose.
מחקר זה נתמך על ידי Forschungsgemeinschaft דויטשה DFG תחת מספר מענק FO 315/4-1 וDFG SFB 688.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |