Deze methode wordt beschreven hoe isoleren en onsterfelijk microvasculaire endotheelcellen van muizenhersenen. We beschrijven een stap-voor-stap protocol vanaf het homogeniseren van het hersenweefsel, digestie stappen zaaien en immortalisatie van de cellen. Meestal duurt het ongeveer vijf weken voor het verkrijgen van een homogene, vereeuwigd microvasculaire endotheliale cellijn.
Epitheel-en endotheelcellen (EC) bouwen paracellulaire barrières die het weefsel te beschermen tegen de externe en interne omgeving. De bloed-hersenbarrière (BBB) bestaande uit EG, astrocyten end-voeten pericyten en basaal membraan is verantwoordelijk voor de bescherming en homeostase van het hersenparenchym. In vitro BBB modellen zijn standaard tools de structuur en functie van de BBB bestuderen op cellulair niveau. Een aanzienlijk aantal verschillende in vitro BBB-modellen zijn vastgesteld voor het onderzoek in verschillende laboratoria tot nu toe. Gewoonlijk worden de cellen van runderen, varkens, rat of muis hersenweefsel (besproken in het overzicht door Wilhelm et al.. 1). Monsters van menselijk weefsel zijn alleen beschikbaar in een beperkt aantal laboratoria of bedrijven 2,3. Terwijl de primaire celpreparaten zijn tijdrovend en het EG-culturen kunnen verschillen van partij tot partij, de oprichting van vereeuwigd EG lines is de focus van het wetenschappelijk belang.
Hier presenteren we een methode voor het vaststellen van een onsterfelijk hersenen microvasculaire EC lijn van neonatale hersenen van muizen. We beschrijven de procedure stap voor stap bedrijf de reagentia en oplossingen gebruikt. De methode, die door ons laboratorium kan de isolatie van een homogene geïmmortaliseerde endotheelcellijn binnen vier tot vijf weken. De hersenen microvasculaire endotheliale cellijnen genoemd CEND 4 (van cerebrale cortex) en cerebEND 5 (van cerebellaire cortex) werden geïsoleerd volgens deze procedure in de Förster laboratoria en zijn effectief gebruikt voor een uitleg van verschillende fysiologische en pathologische processen bij de BBB. Met CEND en cerebEND we hebben aangetoond dat deze cellen reageren op glucocorticoïden 4,6-9 oestrogeen-behandeling 10 alsook pro-infammatory mediatoren, zoals TNFa 5,8. Bovendien hebben we de pathologie van meerdere sclerosis 11 en hypoxie 12,13 op de EG-niveau. De CEND en cerebEND lijnen kan worden beschouwd als een goed hulpmiddel voor het bestuderen van de structuur en functie van de BBB, cellulaire reacties van EC op verschillende stimuli of interactie van de EC met lymfocyten of kankercellen.
De beschreven procedure kan worden gebruikt voor isolatie van microvasculaire EC van verschillende muizenstammen en van verschillende knock-out muizenstammen het bestuderen van de specifieke veranderingen in vasculaire endotheelfunctie. Als methode immortalisatie we de transformatie oncoproteïne van muizen polyomavirus, Polyoma middle T antigen. Het verandert snel onrijpe endotheelcellen in vivo en in vitro 20,21,22. Andere methoden immortalisatie van EC in de literatuur omvatten bijvoorbeeld de immortalisatie met SV40 grote T antigen van Simian Virus 40 Vacuola 23 adenovirus E1A genproduct 24 of overexpressie van de katalytische subeenheid van menselijk telomerase 3. De immortalisatie met PymT specifiek is voor de murine onrijpe EC, waardoor het verkrijgen van een homogene EC cultuur van neonatale muizen in een korte tijd. Immortalisatie verandert de eigenschappen van de cellen en ee resultaten verkregen met geïmmortaliseerde cellijnen kan gebruik worden vergeleken met primaire cellen of in vivo experimenten met muizen. PymT onsterfelijk EG is beschreven hoge fibrinolytische activiteit als gevolg van verhoogde productie van urokinase-type plasminogeen activator drukken en verlaagde productie van plasminogeen activator remmers 25. Rechtstreekse vergelijking PymT geïmmortaliseerde cellijn met bEND5 primaire EC gebleken dat zowel in vitro modellen BBB goed geschikt zijn voor T celadhesie studies 26.
De cellijnen vastgesteld overeenkomstig de beschreven procedure kan worden gebruikt bij lage passage nummer barrière-eigenschappen te behouden door een hoge expressie van BBB en EC junctional eiwitten, cellen verliezen deze eigenschappen tijdens veroudering. Dus na het verlies van barrière-eigenschappen, moet de voorbereiding van een nieuwe cellijn worden overwogen. Cell plating dichtheid hoog moet zijn voor EC, omdat dit essentieel voor celproliferatie. Dit moet worden gezien in de loop van de isolatie procedure, alsmede het onderhoud van de vereeuwigd EC. Elke nieuwe cellijn moeten worden getest op de barrière-eigenschappen en mogelijke verontreinigingen met andere celtypen. EC monolagen kunnen worden gekleurd met anti-galactocerebroside, anti-gliale fibrillaire zure proteïne en anti-gladde spier antigen als primaire antilichamen tegen de besmetting met oligodendrocyten, astrocyten en pericyten 4,27 uitsluiten. Uitsluiten besmetting door meningal vasculatuur kan de expressie van trombomoduline te testen, uitgedrukt in alle vasculaire bedden met uitzondering van de hersenen 28.
Interessant is dat de geïmmortaliseerde microvasculaire endotheliale cellijnen geïsoleerd uit verschillende hersengebieden verschillen in hun barrière-eigenschappen en gevoeligheid voor pro-inflammatoire stimuli. Als voorbeeld kan de cerebrale en cerebellaire CEND cerebEND cellijnen worden vermeld 4,5. CerebEND toonden in vergelijkingnaar CEND, lagere expressie niveaus van de belangrijkste tight junction componenten claudin-1 en occludin. De niveaus van claudin-3 en -12 waren hoger in cerebEND. De barrièrefunctie van cerebEND cellen lijden veel onder behandeling met het ontstekingsmediatoren, TNFa dan de barrière-eigenschappen van CEND cellen deden 5. Cerebellaire hogere gevoeligheid voor inflammatoire stimuli kan worden waargenomen in vivo bij multiple sclerose en in het diermodel experimentele autoimmune encephalomyelitis 29. Deze interessante bevindingen tonen de noodzaak genereren en karakteriseren individu in vitro modellen voor verschillende hersengebieden, om de toekomst drug targeting in de hersenen te verbeteren.
The authors have nothing to disclose.
Dit onderzoek werd ondersteund door de Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG onder licentienummer FO 315/4-1 en DFG SFB 688.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |