この方法では、マウスの脳から微小血管内皮細胞を分離し不死化する方法について説明します。我々は、脳組織、消化手順、播種し、細胞の不死化の均質化から始まるステップ·バイ·ステップのプロトコルを記述します。通常、それは均質、不死化血管内皮細胞株を得るために約5週間かかります。
上皮および内皮細胞(EC)は、外部と内部の環境から組織を保護する傍細胞壁を構築しています。 ECから成る血液脳関門(BBB)、アストロサイトのエンドフィート、周皮細胞と基底膜は、脳実質の保護や恒常性に責任があります。 体外 BBBのモデルでは BBBの構造と機能を研究するための一般的なツールである細胞レベルで。 in vitroでのBBBモデルで異なるの相当数は、これまでの異なる研究室の研究のために設立されています。通常、細胞は、ウシ、ブタ、ラットまたはマウスの脳組織(ウィルヘルムらによる審査で詳細に議論した。1)から得られる。ヒト組織試料は、実験室や企業2,3の限られた数でのみご利用いただけます。初代細胞の調製物は、時間がかかり、ECの文化がバッチにバッチとは異なる場合があります、不死のEC LINの設立ですがesは科学的関心の焦点となっています。
ここでは、新生児マウスの脳からの不死化脳微小血管ECのラインを確立するための方法を提案する。我々は、プロシージャ·ステップ·バイ·ステップのリストを使用した試薬および解決策を説明します。私たちの研究室で確立した方法は、4〜5週間以内に均質な不死化血管内皮細胞株の単離を可能にする。脳毛細血管内皮細胞株はCEND 4と呼ばれる(大脳皮質から)、5(小脳皮質から)cerebEND、フェルスターの研究室では、この手順に従って単離した、効果的に、BBBの異なる生理学的および病理学的プロセスの説明のために使用されている。 CENDを使用して、我々は、これらの細胞はグルココルチコイド4,6-9およびエストロゲン治療10まで並びにTNFアルファ5,8としてプロinfammatoryメディエーターに応答することが実証されているcerebEND。また、複数のSCの病理を研究してきたlerosis 11とEC-レベルの低酸素12,13。 CENDとcerebEND線はBBBの構造と機能を研究するための優れたツール、リンパ球や癌細胞と異なる刺激やECの相互作用にECの細胞応答とみなすことができる。
説明する手順は、血管内皮機能の特定の変化を研究するために、異なるマウス系統からだけでなく、さまざまなノックアウトマウス系統からの微小血管ECの切り分けに使用することができます。 不死化の方法として、我々は、マウスポリオーマウイルス、ポリオーマミドルT抗原の癌タンパク質の形質転換を使用していました。これは、in vivoおよび in vitro 20,21,22 で急速に未熟な内皮細胞を変形させる。文献に記載されているECの不死化する他の方法は、例えばSV40ラージサル空胞化ウイルスのT抗原40 23、アデノウイルス遺伝子産物E1A 24またはヒトテロメラーゼ3の触媒サブユニットを過剰発現させると不死化を含む。 PymTと不死化は短時間で新生児マウスから均質のEC文化を得ることを可能にするマウス未熟ECS、特異的である。不死化は、細胞及び番目のプロパティを変更不死化細胞株を用いて得られた電子の結果は、一次細胞またはマウスを用いたin vivoでの実験とのどちらと比較する必要があります。 PymT不死ECはウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子の産生の増加に起因する線維素溶解活性を高レベルに発現することが記載とプラスミノーゲン活性化因子阻害剤25の産生を減少させてきた。プライマリとPymT bEND5不死細胞株の直接比較は 、in vitro BBBモデルの両方がよくT細胞接着の研究26に適していることを明らかにしたECS。
記載の手順に従って確立された細胞株は、細胞が老化中にこれらのプロパティを失うように、BBBとECの接合部タンパク質の高発現によりバリア性を維持するために低継代数で使用することができます。したがって、バリア性の損失の後、新たな細胞株の調製は、考慮されるべきである。これは細胞増殖に重要であるとして、細胞播種密度は、ECSの高いはずです。これは、単離手順と同様に不死ECのメンテナンスの際に考慮しなければならない。それぞれの新しい細胞株は、その障壁特性及び他の細胞型では不可能汚染物質に対するテストする必要があります。 ECの単層をオリゴデンドロサイト、アストロサイトおよび周皮4,27による汚染を除外するために一次抗体として抗ガラクトセレブロシド、抗グリア線維性酸性タンパク質と抗平滑筋抗原で染色することができます。 meningal血管系による汚染を排除するために、トロンボモジュリンの発現が脳の28を除いた全ての血管床で表現されて、テストすることができます。
興味深いことに、異なる脳領域から分離された不死化微小血管内皮細胞株は、プロ炎症性刺激に彼らのバリア性と感受性が異なります。例として、大脳や小脳CEND cerebEND細胞株を4,5挙げることができる。 CerebEND比較で示した、主要なタイトジャンクションコンポーネントclaudin-1のとオクルディンの低い発現レベルをCENDます。しかし、クローディン-3、-12のレベルはcerebENDで高かった。 cerebEND細胞のバリア機能は、炎症性メディエーターを用いた治療の下ではるかに苦しんだ、CEND細胞のバリア特性よりTNFαは5でした。炎症性刺激に高い小脳の脆弱性、多発性硬化症患者における脳脊髄炎と29の実験自 己免疫の動物モデルを用いたin vivo で観察することができます。これらの興味深い知見は、脳の中に将来の薬物ターゲティングを改善するために、異なる脳領域のためのin vitroモデル個体を生成し、特徴付けるの必要性を示す。
The authors have nothing to disclose.
この研究は、助成番号FO 315/4-1とDFGのSFB 688の下にドイツ学術振興DFGによってサポートされていました。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |