此方法描述了如何从小鼠脑微血管内皮细胞隔离和不朽。我们描述了一个一步一步的协议,从同质化的脑组织,消化步骤,播种和永生化的细胞。通常情况下,大约需要五周获得一个同质的,永生的微血管内皮细胞系。
上皮细胞和内皮细胞(EC)的建筑旁的壁垒保护组织的外部和内部环境。血脑屏障(BBB)的EC,星形胶质细胞最终脚,周细胞和基底膜负责保护和脑实质的动态平衡。, 在体外 BBB车型的常用工具BBB的结构和功能的研究在细胞水平上。在不同的实验室的研究有相当多的不同的体外 BBB模型已经建立。一般,将细胞从牛,猪,大鼠或小鼠的脑组织(Wilhelm 等中详细讨论的评论1)获得的。只适用于有限数量的实验室或公司2,3人体组织样本。虽然原代细胞的准备工作耗时和EC文化的不同的批次,建立永生EC林ES的重点是对科学的兴趣。
在这里,我们提出了建立一个永生的脑微血管EC线从新生鼠脑的方法。我们描述的步骤一步一步上市的试剂和解决方案。由我们的实验室确定的方法允许均匀的永生化的四到五个星期内的内皮细胞株的隔离。脑微血管内皮细胞株被称为CEND 4(大脑皮层)和cerebEND 5(从小脑皮质),根据此过程中福斯特实验室分离并已有效地用于解释不同的生理和病理过程中的BBB。使用CEND和cerebEND我们已经证明,这些细胞对糖皮质激素4,6-9和雌激素治疗10到的亲infammatory介质,如TNFalpha 5,8。此外,我们还研究了病理多个SClerosis的EC-11和缺氧12,13。的的CEND和cerebEND线可以被认为是一个很好的工具为不同的刺激,互动的EC细胞或肿瘤细胞的结构和功能研究的BBB内皮细胞,细胞的反应。
所描述的程序可用于隔离的微血管内皮细胞从不同的小鼠品系,以及从不同的基因敲除小鼠品系,研究具体的血管内皮功能的变化。 作为永生的方法,我们采用了与癌基因的小鼠多瘤病毒,多瘤中T抗原转变。迅速转化未成熟的血管内皮细胞, 在体内和体外 20,21,22。在文献中描述的内皮细胞的永生化的其它方法包括,例如,丝棉空泡病毒SV40大T抗原40 23,腺病毒基因产物E1A 24或过度的催化亚基端粒酶3的永生化。的永生与PymT是特异于小鼠未成熟的内皮细胞,这可以从新生小鼠在很短的时间内获得均匀的EC文化。永生化的改变的细胞的性质和th与原代细胞或小鼠体内的实验中得到永生细胞株的E结果应该是比较。 PymT永生已被形容为EC表达高水平的纤维蛋白溶解活性,导致尿激酶型纤溶酶原激活物增加生产,降低生产型纤溶酶原激活物抑制剂25。直接比较PymT永生bEND5与初级内皮细胞系表明血脑屏障体外模型非常适用于T细胞的粘附研究26。
建立的细胞系,根据所描述的过程,可以使用在低通道数保持阻隔性能通过BBB和EC交界蛋白质的高表达的,例如细胞衰老过程中失去了这些属性。因此阻隔性能的损失后,应考虑编制一个新的细胞系。应该是高内皮细胞接种密度,因为这是细胞增殖的关键。在分离过程中,必须考虑以及维护的永生化内皮细胞。应测试每一个新的细胞系,其阻隔性和与其他类型的细胞的可能的污染物。 EC单层可与作为第一抗体的抗-半乳糖脑苷,抗神经胶质原纤维酸性蛋白和抗平滑肌抗原染色排除污染的少突胶质细胞,星形胶质细胞和周细胞4,27。为了排除污染meningal脉管,血栓调节蛋白的表达,可以进行测试,这是表示在所有血管床的与异常的脑28。
有趣的是,永生微血管内皮细胞系中分离出不同的大脑区域不同,其阻隔性和敏感性,有利于炎症的刺激。脑CEND和小脑cerebEND的细胞系作为一个例子,可以举出4,5。 CerebEND表明,在比较CEND,主要紧密连接的部件紧密连接蛋白1和occludin的表达水平较低。不过,该水平的claudin-3和-12在cerebEND高。的屏障功能cerebEND细胞遭受更与炎症介体的处理下,TNFα比的阻隔性能CEND细胞做了5。高等小脑炎症刺激的脆弱性,可以观察到在体内在多发性硬化症患者和动物模型的实验性自身免疫性脑脊髓炎29。这些有趣的发现表明,在为了改善未来的靶向药物进入大脑产生和表征个人的体外模型不同脑区的必要性。
The authors have nothing to disclose.
这项研究是由德国研究联合会DFG支持下的授权号FO 315/4-1和DFG SFB 688。
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A7906 | Purity > 98% |
collagen IV | Sigma-Aldrich | C5533 | 50 μg/ml in 50 mM acetic acid |
Collagenase/ Dispase | Roche | 10269638001 | |
Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Sigma-Aldrich | D5796 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | PAA Laboratories | A15110-1333 | final concentration 10%, heat-inactivated (30 min at 56 °C) |
L-glutamine | Biochrom AG | K0282 | Storage: ≤ -15 °C |
MEM Vitamine | Biochrom AG | K0373 | Storage: ≤ -15 °C |
Na-pyruvate | Biochrom AG | L0473 | |
Neomycin (G418) | PAA Laboratories | P11-012 | |
Non essential amino acids (NEA) | Biochrom AG | K0293 | Storage at 4 °C |
Penicilin/Streptomycin | Biochrom AG | A2212 | Storage: ≤ -15 °C |
Phosphate buffered saline (PBS) | Biochrom AG | L1825 | |
Polybrene (hexadimethrine bromide) | Sigma-Aldrich | 107689 | 0.8 mg/ml in PBS, storage at -20 °C |
Puromycin | Sigma-Aldrich | P8833 | |
Trypsin/EDTA | Biochrom AG | L1825 | 0.05%, 0.02% EDTA in PBS |