Burada makromoleküler X-ışını kristalografisi yapı belirleme kullanım için lipidik kübik ve sünger aşamalarında büyüdü hasat ve kriyo-serin membran proteini kristaller Yapısal ve İşlevsel Biyoloji Grup Caffrey Membran uygulanan prosedürler açıklanmıştır.
Proteinler mekanistik bir seviyede nasıl işlediğini anlamak için önemli bir rota ideal atomik çözünürlükte, mevcut hedef proteinin yapısına sahip olmaktır. Halen orada integral membran proteinleri (Şekil 1), ve bunların oluşturdukları kompleksler uygulanan gibi bilgileri yakalamak için tek bir yol olduğunu ve bu yöntem makromoleküler X-ışını kristalografisi (MX) 'dir. MX kırınım kalite kristaller zar proteinlerinin durumunda, ihtiyaç bulunmaktadır yapmak için, kolayca oluşturmaz. Lipidik mesophases, özellikle kübik ve sünger fazlar 1-5 kullanımını gerektirir membran proteinleri kristalize için bir yöntem (bu G protein-kenetli reseptör alanında 6-21 içinde olmuştur başarıları nedeniyle geç de dikkat kazanmıştır www . mpdb.tcd.ie ). Bununla birlikte, bu yöntem, bundan sonra mezo veya lipidik kübik faz yöntemi olarak adlandırılan, kendi teknik ile birliktezorluklar. Bu nedeniyle sık sık mikro kristalleri kristaller olarak büyümesi olan lipidik mezofaz genel olarak viskoz ve yapışkan doğası, kısmen ortaya çıkar. Kristaller işleme 22,23 hasat sırasında sonuç olarak zor ve özellikle çok olur. Problemler kriyo-soğutma ve nihai X, hasat için, kristaller burada kristalleri (Şekil 2) 24,25 büyüdüğü içinde cam sandviç plakaların mezofaz bolus ortaya çıkarmak için açılmış olmasını gerektirir ki hasat önce gelen basamakta da ortaya çıkar, ve -ışını kırınım veri toplama.
Kristaller hasat edilmelidir hangi kübik ve sünger Mezofaz türevleri (Şekil 3) derinden farklı rheologies 4,26 var. Kübik faz kalın bir diş macunu benzer yapışkan ve yapışkan. Buna karşılık, sünger fazlı akış için ayrı bir eğilim ile daha akışkandır. Açılış kristalizasyon kuyuları containi için Buna göre, farklı yaklaşımlarkübik ve sünger faz içinde gelişen kristaller ng gerçekten farklı yöntemler iki mezofaz tür kristal hasadı için gerekli olmasından dolayı, çağrılır. Rafine ve uygulanan Membran Yapısal ve İşlevsel Biyoloji (MS & FB) Grubu ve bu Jove makale (Şekil 4) ayrıntılı olarak açıklanmıştır oylandı sadece yapmak için protokoller. Örnekler kristaller başarıyla hasat ve kriyo-soğutulur durumlarda verilir. Ayrıca problemler kristaller onarılamaz kaybına neden olduğu durumlarda ortaya çıkan örnekler verilmiştir ve bu sorunların önlenebilir açıklanmıştır. Bu makalede Görüntüleyicisi hasat için, cam sandviç kristalizasyon kuyu açılması ve kübik ve sünger aşamalarında büyüyen membran proteinlerinin kriyo-soğutma kristalleri için adım adım yönergeler sağlanmaktadır.
Bu video yazıda lipidik Mezofaz yetiştirilen kristaller hasat ve kırınım veri toplama kullanılmak üzere hazırlık ve sonuçta yapı tayini için kriyo-soğutmalı nasıl gösterdi. Hosting Mezofaz viskoz ve yapışkan kübik faz veya daha fazla sıvı sünger faz 4 olabilir. Cam sandviç plakaların nasıl açılır ve kristallerin çok fazla hasat edilir nasıl mezofaz türüne bağlıdır. Bu vaktinden uğraşıyor iki birinin olduğunu bilmek önemlidir. Barındırma lipid ve ikinci çöktürücü ve kimlik bu açıdan önemli olan ve kristalleşme de mezofaz bolus fiziki görünüş de (Şekil 3) birbirinden ayırmak için kullanılabilir. Her iki Mezofaz türlerinden Hasat bu makalede izah edildi.
Cam sandviç plakaları bir lipidik Mezofaz gelen küçük kristaller Hasat zamanı, beceri, exper gerektiren zahmetli bir süreçtirience, sabır ve istikrarlı bir el. Tüm malzeme ve teçhizat önceden hazır olduğundan böylece hasat için zaman uygun miktarda bir kenara bırakarak ve laboratuar kurmak için önemlidir. Hasat ile yardımcı olmak için bir ikinci kişi gerekli değil ama tavsiye edilir. Bu kişi hasat yapıyor bireysel ön işaretli tabak tedarik yanı sıra depolama disk içine hasat kristalleri ile cryo sogutmali monte döngüler yerleştirilmesi için yardımcı olabilir. Ayrıca, asistan kırınım veri toplama sırasında önemli kanıtlamak olabilir hasat sırasında yapılan kristalleri üzerinde gözlemler belgeleyen önemli bir destek rolü oynayabilir. Asistan yokluğunda, ses ile aktive ses-kayıt cihazı dokümantasyon için avantaj için kullanılan olabilir.
Bu makalede açıklanan protokol sonrasında Görüntüleyicisi kalk ve kristal hasadı ile çalışan yardımcı olacaktır. Bununla birlikte, bu işlem kolay değildir ve bu olduğunu takdir için önemli olan practice değerli membran protein kristalleri hasat içine başlatmadan önce gereklidir. Özellikle değerli değildir protein kristalleri ile test plakaları ilk denemeleri bu nedenle tavsiye edilir. Bu cam kesme değerli bir deneyim ile acemi sağlayacak, cam parçaları kaldırarak Mezofaz yerinden coverglass yukarı kaldırarak, kristaller görmek ve hasat sırasında onları izlemek için mikroskopta polarize özelliğini kullanarak, ve nihayet mesophases farklı türleri ele ve onlardan hasat. Ve uzatma kristaller hasat edilebilir hangi ile kolaylığı, Mezofaz dokusu kristalleşme sırasında zaman ile değişimi yapar. Daha az değerli kristaller ile ama daha değerli olanları aynı koşullar altında yetiştirilen verdiğiniz kişiler ile hasat uygulama için bu nedenle önemlidir. Bu, mezo veya lipidik kübik faz yöntemi 28 ile lizozim ve thaumatin kristallerinin büyümesini mümkün olduğunu ve bu consid olmalıdırmalzemeler ve yöntem ile elde yakınlık yoluyla uzanırlar. Bir de onun kaprislerine öğrenmek için ilk protein içermeyen Mezofaz çalışan düşünmelisiniz.
Burada gösterilen prosedürler tüm rahat bir 20 ° C veya oralarda yapıldı. Bu, daha düşük sıcaklıklarda mezo yöntemi ile kristallerin büyümesi mümkündür. Bu nedenle, bir yarı kararlı durum faz içinde barındıran lipid olarak monoolein 4 ° C'de 1,2,29,30 de kullanılabilir. Alternatif bir düşük sıcaklıkta kristalleşme 31 için rasyonel bir şekilde tasarlanmış 7,9 MAG kullanmaktır. Biz belli membran proteini hedefleri ile rutin düşük sıcaklık crysallogenesis yapın. Bu durumda, kristal büyüme ve hasat bir gömme 4 ° C'de soğutma yapılır. Bu koşullar altında çalışmak sıcak ve rahat kıyafetleri ihtiyacı olan değil, en az olan kendi zorlukları vardır.
Makromoleküler crys kullanarak yapı tayini genel sürecinde sonraki adımtallography kristaller hasat ve bu makalede gösterildiği gibi ek soğutmalı üzerine kırınım veri toplamaktır. mezo-yetiştirilen yılında kristaller genellikle küçük. Bununla birlikte, kullanışlı kırınım veri toplama 20 mikron 9 olduğu bir maksimum boyuta sahip olan kristalleri ile mümkün olmuştur. Bu amaç için, mikro-ışın sinkrotron X-ışını kullanılan ve bu seri 32,33 ayrı bir Jüpiter madde amacı, bir edilir.
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmaya katkıda ve en Yapısal Caffrey Membran ve Fonksiyonel Biyoloji Grup, geçmiş ve şimdiki üyeleri hem birçok kim vardır. Tüm için, ve özellikle Jingquan Tan ve Joseph Lyons, bizim en içten teşekkürlerimizi ve şükranlarımızı. Bu eser Bilim Vakfı İrlanda (07/IN.1/B1836), Ulusal Sağlık Enstitüleri (GM75915, P50GM073210 ve U54GM094599) ve FP7 COST ve Marie Curie Eylemleri (CM0902 ve PIEF-GA-2009 hibeleri ile kısmen desteklenmiştir -235612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |