여기가 macromolecular X-선 결정학을 사용하여 구조 결정에 사용하기 위해 lipidic 입방와 스폰지 단계에서 재배 수확 및 cryo-시원한 막 단백질 결정에 대한 구조 및 기능 생물학 그룹 팀장 막에서 구현 절차를 설명합니다.
단백질은 기계론의 수준에서 작동하는 방법 이해에 중요한 경로는 이상적으로 원자 해상도에서 사용할 수있는 대상 단백질의 구조를 가지고하는 것입니다. 현재이 통합 막 단백질 (그림 1), 그리고 그들이 형성 단지에 적용과 같은 정보를 캡처하는 방법은 하나이며, 그 방법은 macromolecular X-선 결정학 (MX)입니다. MX 회절 품질 결정은 막 단백질의 경우, 어떤이 필요한하려면 쉽게 형성하지 않습니다. lipidic mesophases, 특히 입방와 스폰지 단계 1-5,의 사용을 포함 막 단백질을 crystallizing하기위한 방법은 (는 G 단백질 결합 수용체 필드 6-21에있었습니다 성공에 늦게 인해 상당한 관심을 받고있다 WWW . mpdb.tcd.ie ). 그러나, 방법, 금후 meso 또는 lipidic 입방 단계 방법에라고, 자신의 기술을 갖추고 있습니다도전. 이러한 인해 종종 마이크로 결정하는 결정이 성장하는 lipidic mesophase의 일반적으로 점성과 끈적 자연, 부분적으로 발생합니다. 결정을 조작하는 것은 22,23 수확하는 동안 결과로 어렵고 특히 이렇게된다. 문제는 cryo – 냉각 및 최종 X, 수확을 위해 결정 안에 결정합니다 (그림 2) 24,25 성장하는 유리 샌드위치 플레이트가 mesophase의 bolus를 노출 개설하는 요구되는 수확 앞에 단계에서 너무 발생하고, 선 회절 데이터 수집.
결정을 수확해야되는 입방와 스폰지 mesophase 변종 (그림 3)은 아주 다른 rheologies에게 4,26가 있습니다. 입방 단계는 두꺼운 치약과 유사한 점성과 끈적입니다. 대조적으로, 스폰지 단계 흐름에 뚜렷한 경향으로 더 많은 액체입니다. 개방 결정 우물 containi에 따라서, 서로 다른 접근 방식입방와 스폰지 단계에서 성장 NG 결정은 정말로 다른 방법이 두 mesophase 형식에서 결정을 수확하는 데 필요한대로에라고합니다. 세련되고 구현 된 막 구조 및 기능 생물학 (MS & FB) 그룹에,이 목성 문서 (그림 4)에 자세히 설명되어 있습니다되었습니다 만 이에 대한 프로토콜. 예는 결정이 성공적으로 수확하고 cryo – 냉각되는 상황으로 주어집니다. 우리는 또한 문제가 크리스탈 회복 할 수없는 손해에 해당 리드를 발생 가지 경우 예를 제공하고 이러한 문제를 방지 할 수 있습니다 방법에 대해 설명합니다. 이 문서에서는 Viewer는 수확을 위해, 유리 샌드위치 결정 우물을 열 및 입방와 스폰지 단계의 성장을 막 단백질의 cryo – 냉각 결정에 대한 단계별 지침을 제공합니다.
이 동영상 글에서 우리는 lipidic mesophase에서 재배 결정은 수확과 회절 데이터 수집에 사용하기 위해 준비하고 궁극적으로 구조 결정에 대한 cryo – 냉각하는 방법을 보여 주었다. 호스팅 mesophase은 점성과 끈적 입방 단계 또는 더 유연 스폰지 4 단계가 될 수 있습니다. 유리 샌드위치 판을 열 방법과 결정은 매우 수확하는 방법은 mesophase 유형에 따라 달라집니다. 그것은 미리 처리되어 두 사람의인지 알아 것이 중요합니다. 호스팅 지질 및 사용 침전제의 신원은이 문제와 관련하여 중요한 있으며, 결정의 mesophase bolus의 신체적 인 외모가 잘 (그림 3)을 구별하는 데 사용할 수 있습니다. 두 mesophase 형식에서 수확는이 문서에서 설명되었다.
유리 샌드위치 플레이트의 lipidic mesophase의 작은 결정을 수확하는 것은 시간, 기술, exper을 요구하는 정성 과정ience, 인내와 침착. 모든 물자와 장비를 사전에 손에 있습니다 있도록 그것은 수확 시간의 적절한 금액을 따로 설정하고 실험을 설정하는 것이 중요합니다. 수확을 지원하는 두 번째 사람이 중요하지 않지만 권장합니다. 그 사람은 수확을하는 개인에게 사전 마크 접시를 공급뿐만 아니라 저장 퍽에 수확 결정으로 cryo 냉각 장착 루프를 배치에 도움을 줄 수 있습니다. 조수는 회절 데이터 수집 동안 중요한할만한 수확하는 동안 한 결정에 관찰을 문서화하는 데 중요한 지원 역할을 재생할 수 있습니다. 비서의 부재에서 음성 반응 오디오 녹음 장치가 문서에 유리하게 사용될 수있다.
이 문서에서 설명하는 프로토콜을 따라하면 뷰어의 설치 및 크리스탈 수확을 실행하는 데 도움이됩니다. 그러나 프로세스가 간단하지 않으며 것을 감사하는 것이 중요하다 레슨ctice는 귀중한 막 단백질 결정 수확을 실행하기 전에 필요합니다. 그것은 특히 유용한하지 않은 단백질의 결정과 테스트 판을 처음으로 실험을 할 수하는 것이 좋습니다. 이 유리를 절단의 귀중한 경험과 초보 사제을 제공 할 것, 유리 파편을 제거 mesophase 이상에서 coverglass를 리프팅, 결정을 확인하고 수확하는 동안 그들을 추적하는 현미경에 편광 기능을 사용하여, 마지막 mesophases의 다른 유형을 취급 그들과 수확. , 및 확장 결정을 수확 할 수있는 용이성에 의해, mesophase의 질감이 결정하는 동안 시간이 변경됩니다. 그것은 가치가 덜하고 결정을하지만 더 가치들과 같은 조건에서 재배 한 그 사람들과 수확 연습을하는 것이 중요합니다. 이 meso 또는 lipidic 입방 단계 방법 28에 의해 라이소자임과 thaumatin의 결정 성장을 할 수 있으며, 이것들은 consid해야자료와 방법으로 친숙를 취득 의해 ered. 하나는 또한 vagaries의 내용은 첫째 단백질 무료 mesophase 작업을 고려해야합니다.
여기를 입증 절차는 모두 편안한 20 ° C에서 또는 그 당시 수행되었다. 그것은 낮은 온도에서 meso 방법에 의해 결정 성장을 할 수 있습니다. 따라서, metastable 단계 상태에서 호스팅 지질 등의 monoolein은 4 ° C 1,2,29,30에서 사용할 수 있습니다. 대안은 저온 결정화 31 이성적으로 설계된 7.9 MAG을 사용하는 것입니다. 우리는 특정 막 단백질 타겟 정기적으로 저온 crysallogenesis 해. 이 경우, 크리스탈 성장과 수확은 대형 4 ° C 냉장고에서 이루어집니다. 이러한 조건 하에서 일하는 것은 따뜻하고 편안한 복장이 필요하지 않습니다 적어도 고유의 문제가 있습니다.
macromolecular의 crys를 사용하여 구조 결정의 전체 프로세스의 다음 단계tallography이 결정 수확이 문서에서 보여준 것처럼 스냅인 냉각에 회절 데이터를 수집하는 것입니다. meso 자체에서 결정은 일반적으로 작은 수 있습니다. 그러나, 유용한 회절 데이터 수집은 20 μm 9 최대 크기를 갖는 결정 가능했습니다. 이를 위해, 마이크로 빔 싱크로트론 X-방사선를 사용하고이 시리즈 32,33에서 별도의 주피터 기사의 초점입니다.
The authors have nothing to disclose.
이 작품에 공헌하고 대부분의 구조 캐 프리 막 및 기능 생물학 그룹, 과거와 현재 회원 모두에서 많은 사람이 있습니다. 모든, 특히 Jingquan 단, 요셉 라이언스에, 우리는 따뜻한 감사와 감사를 확장합니다. 이 작품은 과학 재단 (NSF) 아일랜드 (07/IN.1/B1836), 국립 보건원 (GM75915, P50GM073210 및 U54GM094599) 및 FP7 COST와 마리 퀴리 작업 (CM0902와 PIEF-GA-2009 교부금의 일부 지원이 -235612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |