يوصف هنا الإجراءات المنفذة في الغشاء Caffrey الهيكلية والوظيفية لمجموعة الأحياء بلورات الحصاد والبرد بارد من البروتين غشاء شحمي تزرع في مراحل مكعب والإسفنج لاستخدامه في تحديد هيكل الجزيئات باستخدام الأشعة السينية البلورات.
طريقا هاما لفهم كيفية البروتينات تعمل على مستوى الآلية هو أن يكون هيكل البروتين المستهدف المتاحة، من الناحية المثالية في قرار الذرية. في الوقت الحاضر، لا يوجد سوى طريقة واحدة لالتقاط هذه المعلومات كما ينطبق على البروتينات الغشاء لا يتجزأ (الشكل 1)، وأنها تشكل المجمعات، وهذا الأسلوب هو الجزيئات البلورات بالأشعة السينية (MX). للقيام البلورات هناك حاجة MX نوعية حيود التي، في حالة من البروتينات الغشاء، لا تشكل بسهولة. وقد اكتسب طريقة لبلورة البروتينات الغشاء الذي ينطوي على استخدام mesophases شحمي، وتحديدا في المراحل مكعب والاسفنج 1-5، اهتماما كبيرا من المقرر في وقت متأخر إلى النجاحات وكان له في مستقبلات البروتين G مجال يقترن 6-21 ( شبكة الاتصالات العالمية . mpdb.tcd.ie ). ومع ذلك، وهي طريقة، المشار إليه فيما لفي المتوسط شحمي أو أسلوب المرحلة مكعب، ويأتي مع التقنية الخاصة بهاالتحديات. هذه تنشأ، في جزء منه، نظرا لطبيعة لزجة لزجة وعموما من mesophase شحمي فيه البلورات، والتي غالبا ما تكون بلورات متناهية الصغر، وتنمو. بلورات يصبح من الصعب التلاعب نتيجة لذلك وخاصة أثناء الحصاد 22،23. تنشأ مشاكل أيضا في الخطوة التي تسبق الحصاد الذي يتطلب أن يتم فتح الزجاج لوحات ساندويتش التي تنمو بلورات (الشكل 2) 24،25 لفضح البلعة mesophase، وبلورات فيه، للحصاد، البرد التبريد وX في نهاية المطاف حيود أشعة جمع البيانات.
المتغيرات mesophase مكعب والإسفنج (الشكل 3) من الذي يجب أن يكون حصاد بلورات مختلفة rheologies عميقا 4،26. المرحلة مكعب هو لزج ودبق أقرب إلى معجون الأسنان سميكة. على النقيض من ذلك، فإن المرحلة الاسفنج هو أكثر مرونة مع وجود اتجاه متميز في التدفق. وفقا لذلك، ونهج مختلفة لبلورة فتح الآبار containiوتسمى بلورات نانوغرام نموا في المرحلة مكعب والاسفنج لكما في الواقع هناك حاجة لأساليب مختلفة من بلورات حصاد أنواع mesophase اثنين. بروتوكولات لتفعل ذلك تم تنقيحها وتنفيذها في الغشاء الأحياء الهيكلية والوظيفية (MS & FB) مجموعة، وصفها بالتفصيل في هذه المقالة إن الرب (الشكل 4). يتم إعطاء أمثلة على الحالات التي تحصد بنجاح بلورات البرد ويبرد. ونحن نقدم أيضا أمثلة على الحالات التي تنشأ مشاكل التي تؤدي إلى خسارة لا تعوض من بلورات وتصف كيف يمكن تجنب هذه المشاكل. في هذه المقالة يتم توفير العارض مع خطوة بخطوة تعليمات لفتح الآبار الزجاج تبلور ساندويتش، للحصاد والبرد التبريد بلورات من البروتينات الغشاء نموا في مكعب وعلى مراحل الاسفنج.
في هذه المقالة الفيديو أثبتنا كيف يتم حصاد بلورات نمت في mesophase شحمي والبرد تبريد استعدادا لاستخدامها في جمع البيانات والحيود في نهاية المطاف لتحديد الهيكل. يمكن للmesophase استضافة تكون المرحلة لزج ودبق أو مكعب المرحلة الإسفنج أكثر مرونة 4. كيف يتم فتح الزجاج لوحات ساندويتش وكيف يتم حصاد هذه البلورات كثيرا يعتمد على نوع mesophase. ولذا فمن المهم أن تعرف أي واحد اثنين من يتعامل مع في وقت مبكر. هوية الدهون استضافة ومرسب المستخدمة هي هامة في هذا الصدد، والمظهر الخارجي للبلعة mesophase في التبلور بشكل جيد يمكن استخدامها لتمييزها عن بعضها البعض (الشكل 3). وقد تجلى الحصاد من كل أنواع mesophase في هذه المقالة.
حصاد بلورات صغيرة من mesophase شحمي في لوحات ساندويتش الزجاج هو عملية مضنية تتطلب وقتا ومهارة، experيتزوج والصبر ومطرد من ناحية. من المهم أن يوضع جانبا مبلغ مناسب من الوقت لجمع وإعداد المختبر حتى يتسنى لجميع اللوازم والمعدات هي في متناول اليد مقدما. A الشخص الثاني للمساعدة في الحصاد ليست ضرورية ولكنها أوصت و. يمكن أن تساعد الشخص مع توريد لوحات ما قبل ملحوظ على الفرد القيام الحصاد وكذلك وضع البرد المبردة الحلقات مزودة بلورات تحصد في عفريت التخزين. يمكن للمساعد أيضا أن تلعب دورا هاما في دعم توثيق الملاحظات على بلورات التي قدمت خلال الحصاد التي قد تكون حاسمة خلال جمع البيانات حيود. في حالة عدم وجود مساعد، يمكن أن تستخدم صوت تنشيط السمعية وتسجيل الجهاز لميزة للتوثيق.
وبعد بروتوكول الموصوفة في هذه المقالة مساعدة في الحصول على عارض وتشغيلها مع الحصاد وضوح الشمس. ومع ذلك، فمن المهم أن نقدر أن العملية ليست واضحة وأن تحليل مخاطر الآفاتوهناك حاجة إلى إطلاق ctice قبل الحصاد قيمة بلورات البروتين الغشاء. ولذلك فمن المستحسن أن جربت لوحات اختبار مع بلورات من البروتينات التي لا قيمة خاصة مع الأول. وهذا سيوفر على المبتديء مع خبرة قيمة في قطع الزجاج، وإزالة شظايا الزجاج، ورفع حتى ساترة من خلال mesophase، وذلك باستخدام ميزة الاستقطاب على المجهر لرؤية بلورات وتعقبهم أثناء الحصاد، وأخيرا التعامل مع أنواع مختلفة من mesophases والحصاد منها. نسيج من mesophase، وبالتالي السهولة التي يمكن حصادها بلورات، هل تغير مع مرور الوقت خلال التبلور. ولذلك فمن المهم لممارسة الحصاد مع بلورات أقل قيمة ولكن مع تلك التي نمت في ظل نفس الظروف ومنها أكثر قيمة. فمن الممكن أن تنمو بلورات الليزوزيم وthaumatin من قبل في المتوسط شحمي أو أسلوب المرحلة مكعب 28 و ينبغي consid هذهered عن طريق كسب الألفة مع المواد والأسلوب. ينبغي للمرء أن ينظر أيضا العمل مع البروتين خالية mesophase أول من تعلم من تقلبات والخمسين.
تم الانتهاء من جميع الإجراءات أثبتت هنا في C ° 20 مريحة أو ما يقرب من ذلك. فمن الممكن أن تنمو بلورات من قبل في طريقة المتوسط في درجات حرارة منخفضة. وبالتالي، يمكن استخدام الدهون monoolein كما في حالة استضافة المرحلة متبدل الاستقرار في 4 1،2،29،30 C °. والبديل هو استخدام تصميم بعقلانية 7،9 MAG لبلورة درجة حرارة منخفضة 31. نفعل انخفاض درجة الحرارة بشكل روتيني crysallogenesis مع بعض الأهداف البروتين الغشاء. في هذه الحالة، يتم نمو البلورات والحصاد في الثلاجة المشي في ° C 4. العمل في ظل هذه الظروف والتحديات الخاصة به وليس أقلها الذي هو الحاجة إلى الملابس دافئة ومريحة.
الخطوة التالية في العملية الشاملة لتصميم هيكل الجزيئات باستخدام بلورةtallography هو جمع البيانات حيود على بلورات حصاد وبرد الإضافية كما هو موضح في هذه المقالة. في المتوسط نابعة من بلورات وعادة ما تكون صغيرة. ومع ذلك، فقد كانت مفيدة لجمع البيانات حيود ممكن مع وجود بلورات بعدا أقصى 20 ميكرون 9. لهذا الغرض، يتم استخدام شعاع السنكروترون الصغيرة X-الإشعاع وهو محور مقالة منفصلة إن الرب في هذه السلسلة 32،33.
The authors have nothing to disclose.
هناك العديد من الذين ساهموا في هذا العمل ومعظمها من الغشاء Caffrey الهيكلية والوظيفية المجموعة الأحياء، وكلاهما عضو في الماضي والحاضر. للجميع، وخاصة ليون وتان جينغ تشيوان يوسف، نتقدم بأحر الشكر والتقدير. وأيد هذا العمل في جزء من المنح المقدمة من مؤسسة العلوم ايرلندا (07/IN.1/B1836)، والمعاهد الوطنية للصحة (GM75915، وP50GM073210 U54GM094599)، وCOST FP7 وماري كوري الإجراءات (وPIEF CM0902-GA 2009- -235612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |