Здесь описаны процедуры, осуществляемые в мембране Кэффри Структурно-функциональная группа биологии для уборки и крио-прохладный мембранных белков кристаллов, выращенных в липидной кубической фазы и губки для использования в составе определения макромолекулярных использованием рентгеновской кристаллографии.
Важный путь к пониманию того, как белки функционируют на уровне механистических должна иметь структуру белка-мишени доступны, в идеале с атомным разрешением. В настоящее время есть только один способ захвата такой информации применительно к интегральные мембранные белки (рис. 1), и они образуют комплексы, и этот метод является макромолекулярных рентгеновской кристаллографии (MX). Чтобы сделать MX кристаллов дифракция качества необходимы которая, в случае мембранные белки, не образуют легко. Метод кристаллизации мембранных белков, что связано с использованием липидных мезофаз, в частности, кубические и губки фазах 1-5, получила значительное внимание опозданием в связи с успехами она имела в G-белком рецептор поля 6-21 ( WWW . mpdb.tcd.ie ). Тем не менее, метод, далее именуемый в мезо или липидные кубический метод фазы, поставляется с собственным техническимпроблемы. Они возникают, в частности, в связи с обычно вязкий и липкий характер липидного мезофазы, в котором кристаллы, которые часто являются микро-кристаллы, расти. Управление кристаллов становится трудно в результате так и, в частности во время сбора урожая 22,23. Проблемы возникают также на этапе, который предшествует сбор, который требует, что стекло сэндвич-плиты, в которых растут кристаллы (рис. 2) 24,25 открыто разоблачать мезофазы болюса, и кристаллы в нем, для сбора урожая, крио-и возможного охлаждения X -лучей коллекции дифракционных данных.
Кубической и губки мезофазы вариантов (рис. 3), из которых кристаллы должны быть собраны имеют совершенно другой rheologies 4,26. Кубической фазы является вязким и липким похожее на толстую зубную пасту. В отличие от этого, губка фазе больше жидкости с отчетливая тенденция к потоку. Соответственно, разные подходы для открытия кристаллизации скважин containiнг выращивания кристаллов в кубической и губка фазы призвал как, впрочем, разные методы, необходимые для сбора кристаллов из двух типов мезофазы. Протоколы делать именно это были усовершенствованы и внедрены в мембране структурной и функциональной биологии (MS & FB) группы, и подробно описана в этой статье Юпитера (рис. 4). Приведены примеры ситуаций, когда кристаллы успешно собирают и крио-охлаждаются. Мы также предоставляем примеры случаев, когда возникают проблемы, которые приводят к безвозвратной потере кристаллов и описать, как эти проблемы можно избежать. В этой статье просмотра снабжен шаг за шагом инструкции для открытия стекла скважин сэндвич кристаллизации, для уборки и для крио-охлаждения кристаллы мембранных белков растет в кубической и в губки фаз.
В этом видео статье мы показали, как кристаллы, выращенные в липидных мезофазы собирают и крио-охлаждали в подготовке для использования в коллекцию дифракционных данных и в конечном итоге для определения структуры. Мезофазы хостинг может быть вязким и липким кубической фазы или больше жидкости губкой фазы 4. Как стеклянных пластин сэндвич открыты и, как кристаллы собирают очень многое зависит от мезофазы типа. Поэтому важно знать, какую из двух речь идет о заранее. Личность хостинг липидов и осадителя использовали важны в этом отношении, и внешность мезофазы болюса при кристаллизации также может быть использован, чтобы сказать им друг от друга (рис. 3). Сбор от обоих типов мезофазы было показано в этой статье.
Уборочная мелких кристаллов из липидных мезофазы в стеклянных пластин бутерброд кропотливый процесс, который требует времени, умения, экспериментовience, терпение и твердая рука. Важно, чтобы выделить достаточное количество времени для сбора урожая и создать лабораторию, чтобы все материалы и оборудование под рукой заранее. Второй человек, чтобы помочь с уборкой урожая не является необходимым, но рекомендуется. Этот человек может помочь с предоставлением заранее отмеченные пластины на отдельные делают заготовки, а также размещения крио-охлаждением установлены петли с кристаллами собраны в хранилище шайбу. Помощник может также играть важную роль в поддержке документирования наблюдений на кристаллы сделанные во время сбора урожая, которые могут сыграть решающую роль в процессе сбора дифракционных данных. При отсутствии помощников, голосовые аудио-и записывающее устройство может быть использовано для преимуществ для документации.
В соответствии с протоколом, описанным в этой статье, поможет получить средства просмотра и работает с кристаллом уборки урожая. Тем не менее, важно понимать, что этот процесс не простой и, что праctice необходимо перед запуском в уборке ценные кристаллы белков мембраны. Поэтому рекомендуется, что тест пластины с кристаллами белки, которые не являются особенно ценными быть экспериментировал с первым. Это обеспечит неофита с ценный опыт в резке стекла, удаляя осколки стекла, поднимая покровного стекла из более чем мезофазы, с помощью поляризационных функций на микроскоп, чтобы увидеть кристаллы и отслеживать их во время сбора урожая, и, наконец, обработку различных типов мезофаз и сбор урожая от них. Текстура мезофазы, и расширением легкость, с которой кристаллы могут быть собраны, меняется со временем в процессе кристаллизации. Поэтому важно, чтобы практиковать уборки с менее ценных кристаллов, но с теми, которые росли в тех же условиях, как и более ценными. Это позволит выращивать кристаллы лизоцима и тауматин в в мезо или липидные кубический метод фазового 28 и это следует рассматЭред путем получения знакомство с материалами и метод. Следует также рассмотреть вопрос о сотрудничестве с белком без мезофазы первыми узнавать своих капризов.
Процедуры продемонстрировали здесь было все сделано на комфортном 20 ° C или около того. Это можно выращивать кристаллы в методе мезо при низких температурах. Таким образом, моноолеина как хостинг липидов в метастабильное фазовое состояние может быть использована при 4 ° С 1,2,29,30. Альтернативой является использование рационально разработан 7,9 MAG для низкой температуры кристаллизации 31. Мы делаем низких температур crysallogenesis регулярно с определенными целями мембранного белка. В этом случае, рост кристаллов и сбор урожая производится в душевой 4 ° C холодильнике. Работая в таких условиях имеет свои собственные проблемы, не последним из которых является потребность в теплой и удобной одежде.
Следующим шагом в общем процессе определения структуры использования макромолекулярных кристалловtallography является сбор данных дифракции на кристаллах собраны и оснастка охлаждается, как показано в этой статье. в мезо-выращенных кристаллов, как правило, небольшие. Тем не менее, полезно дифракции сбора данных стало возможным с кристаллов с максимальным размером 20 мкм 9. Для этого, микро-лучевой синхротронного рентгеновского излучения используется и находится в центре внимания отдельной статьи Юпитер в этой серии 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Есть многие, кто вклад в эту работу, и большинство из мембраны Кэффри Структурно-функциональная группа биологии, как прошлых, так и нынешних членов. Для всех, и особенно для Jingquan Тан и Джозеф Лайонс, мы выражаем нашу искреннюю благодарность и признательность. Эта работа была частично поддержана грантами Научный фонд Ирландии (07/IN.1/B1836), Национального института здоровья (GM75915, P50GM073210 и U54GM094599), и FP7 COST и Мари Кюри (CM0902 и ПМЭФ-GA-2009 -235612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |