本文所描述的过程中实现卡弗里膜的结构和功能的生物集团收获和低温冷膜蛋白晶体生长大分子的X射线晶体结构测定中使用的油脂的立方和海绵阶段。
了解蛋白质的功能在机械水平的一个重要途径是,有靶蛋白的结构,最好是在原子级分辨率。目前,只有一个施加到完整的膜蛋白( 图1),和它们形成的复合物的方式来捕捉此类信息,并且该方法是大分子X-射线结晶器(MX)。要做到MX衍射质量晶体的需要,在膜蛋白的情况下,不容易形成。膜蛋白,包括利用,脂质介孔,特别是的立方和海绵阶段1-5,结晶的方法获得了相当的关注的晚期由于取得了G蛋白偶联受体领域6-21( WWW 。mpdb.tcd.ie )。但是,方法,以下简称为中观或脂质立方相法,配有其自身的技术的挑战。这些出现时,一部分原因是由于脂质中间相性质,在其中,这往往是微晶体,晶体生长的一般粘性和粘性。操作晶体的结果变得困难,特别是在收获22,23。问题出现时太在收获的步骤之前要求的玻璃夹层板,其中晶体的生长( 图2)24,25被打开以暴露中间相丸剂,其中的结晶,收获,低温冷却和最终X -射线衍射数据的收集。
立方和的海绵中间相变体( 图3)晶体收获都必须有深刻的不同的流变性4,26。立方相的粘性和粘类似于一个厚厚的牙膏。与此相反,海绵相多个流体流动具有鲜明的倾向。因此,不同的方法来打开结晶井containing的晶体生长在立方相和海绵相被称为作确实需要不同的方法收获从两个中间相类型的晶体。协议只是做,已细化和落实在膜结构与功能的生物集团(MS&FB),并详细介绍了在此朱庇特的文章( 图4)。实施例中给出的情况,在结晶成功收获和低温冷却的。我们还提供例子的情况下,出现问题,导致无法挽回的损失的晶体,并说明如何避免这些问题都可以。在这篇文章的浏览器提供了一步一步的指示,打开玻璃夹层的结晶井,收获和低温冷却的膜蛋白晶体生长立方和海绵阶段。
在这个视频文章中,我们演示了如何脂质中间相的晶体生长,收获和低温冷却衍射数据收集的准备,最终确定的结构。主机中间相的粘性和粘立方相或更流畅的海绵相4。玻璃夹层板被打开,如何晶体的收获非常依赖于中间相类型。因此重要的是知道这两个1处理的时间提前。托管脂质的身份和所用的沉淀剂在这方面是重要的,和大丸剂中的结晶化的中间相的物理外观,以及可以用来告诉他们分开( 图3)。在这篇文章中,收获从两者中间相类型进行了说明。
收获小晶体从的脂质中间相在玻璃夹层板是一个艰苦的过程,需要时间,技巧,experience,耐心和稳健的手。重要的是要预留适量的收获,并设立了实验室,使所有的用品和设备在手提前。第二协助收割的人是没有必要的,但建议使用。这个人可以帮助提供预显着的板,做收获的个人以及低温冷却安装到存储冰球收获晶体的循环。助理也发挥了重要的支撑作用在记录观察在收获的晶体衍射数据收集过程中,这可能是至关重要的。在一个助手的情况下,语音激活音频记录装置可以有利地使用的文档。
在这篇文章中描述的协议将有助于启动和运行的浏览器与晶体收获。然而,重要的是要理解,该过程并不简单,,的PRActice之前,需要启动到收获宝贵的膜蛋白晶体。因此,建议先测试板不是特别宝贵的蛋白质晶体进行实验。这将提供了宝贵的经验,在切割玻璃的新手,取出玻璃碎片,抬起玻璃罩从中间相,采用偏光显微镜功能晶体和跟踪他们在收获,最后处理不同类型的介孔从他们和收获。中间相的质地,并且通过扩展的难易程度,晶体可以收获,不随时间变化,在结晶过程中。因此重要的是练习价值较低的晶体,但是与那些已经为更有价值的相同的条件下生长的收获。它可以由消旋或脂质立方相的方法28和晶体生长的溶菌酶和thaumatin应应该考虑这些ERED等效的方式获得的材料和方法的熟悉。人们还应该考虑与无蛋白质的中间相,首先要学会它的变幻莫测。
这里展示的程序都在一个舒适的20°C或左右完成。这是可能的内消旋的方法中,在较低的温度下晶体生长。因此,油酸单甘油酯作为宿主脂质在亚稳相状态,可以使用在4℃下1,2,29,30。一种替代方法是使用合理设计的7.9 MAG低温晶化31。我们通常做低温crysallogenesis的,具有一定的膜蛋白指标。在这种情况下,晶体生长和收获在散步,在4℃冰箱中。在这样的条件下工作,有其自身的挑战,其中最重要的是需要温暖和舒适的服装。
使用大分子晶体结构测定的整体过程中的下一步骤的tallography是收获和管理单元冷却在这篇文章中所表现出的对晶体的衍射数据收集。, 在细观生长的晶体通常小。然而,有用的衍射数据收集有可能与具有最大尺寸为20μm的9的晶体。为了这个目的,使用微束同步辐射X-辐射,是一个单独的JOVE这一系列中的相关文章32,33的焦点。
The authors have nothing to disclose.
有很多谁促成了这一工作,大部分是从卡弗里膜的结构与功能的生物集团,无论是过去和现在的成员。 ,尤其是景泉潭和约瑟夫·利昂,我们致以最热烈的感谢和赞赏。这项工作是支持的,部分资金从科学基金会爱尔兰(07/IN.1/B1836人),美国国立卫生研究院(GM75915,P50GM073210的和U54GM094599),FP7成本和玛丽·居里行动(CM0902和PIEF-GA-2009 -235612)。
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |