En este documento se describen procedimientos implementados en la membrana Caffrey Estructural y Biología Grupo funcional a los cristales de la cosecha y crio cool-proteína de membrana lipídicas se cultivan en las fases cúbicas y una esponja para su uso en la determinación de estructura macromolecular usando cristalografía de rayos X.
Una ruta importante para la comprensión de cómo las proteínas funcionar a un nivel mecanístico es tener la estructura de la proteína diana disponible, idealmente en la resolución atómica. Actualmente, sólo hay una manera de capturar información tal como se aplica a proteínas de membrana integral (Figura 1), y los complejos se forman, y que el método es macromolecular cristalografía de rayos X (MX). Para hacer MX cristales de calidad de difracción que se necesitan, en el caso de proteínas de membrana, no se forman fácilmente. Un método para la cristalización de proteínas de membrana que incluye el uso de mesofases lipídicas, específicamente las fases cúbicas y esponja 1-5, ha ganado considerable atención de tarde debido a los éxitos que ha tenido en el campo de receptor acoplado a proteína G 6-21 ( www . mpdb.tcd.ie ). Sin embargo, el método, en adelante referido como el método en meso o lipídica fase cúbica, viene con su propio técnicodesafíos. Éstos se producen, en parte, debido a la naturaleza generalmente viscosa y pegajosa de la mesofase lipídica en la que los cristales, que son a menudo micro-cristales, crecen. Manipular cristales se vuelve difícil como resultado y tan particularmente durante la cosecha 22,23. Los problemas se presentan también en la etapa que precede a la cosecha que requiere que las placas sándwich de vidrio en el que los cristales crecen (Figura 2) 24,25 se abre para exponer el bolo mesofase, y los cristales de la misma, para la cosecha, crio-enfriamiento y X eventuales La difracción de rayos recogida de datos.
Las variantes de mesofase cúbicos y esponja (Figura 3) desde el que los cristales deben ser cosechadas tienen reologías 4,26 profundamente diferentes. La fase cúbica es viscoso y pegajoso similar a una pasta de dientes de espesor. Por el contrario, la fase de esponja es más fluida con una clara tendencia a fluir. En consecuencia, los diferentes enfoques para la apertura de pozos de cristalización containing cristales que crecen en la fase cúbica y la esponja se llaman para como de hecho se requieren diferentes métodos para la recolección de los cristales de los dos tipos de mesofase. Los protocolos para hacer precisamente eso se han ido perfeccionando y aplicado en la membrana de Biología Estructural y Funcional (MS & FB) Group, y se describen en detalle en este artículo Jove (Figura 4). Se dan ejemplos de situaciones en las que los cristales son cosechadas con éxito y crio-enfriado. También proporcionamos ejemplos de casos en los que surgen problemas que conducen a la pérdida irrecuperable de cristales y describir cómo estos problemas pueden ser evitados. En este artículo se proporciona el Visor con instrucciones paso a paso para la apertura de pozos de cristalización de vidrio sándwich, para la cosecha y para la crio-enfriamiento cristales de proteínas de membrana que crecen en cúbico y en las fases de esponja.
En este artículo de vídeo demostramos cómo los cristales crecidos en una mesofase lipídica se cosechan y crio-enfriado en preparación para su uso en la recolección de datos de difracción y en última instancia para la determinación de la estructura. La mesofase de alojamiento puede ser la fase cúbica viscoso y pegajoso o la fase de esponja más fluido 4. Como las placas sándwich de vidrio se abren y cómo los cristales se cosechan mucho depende del tipo de mesofase. Por ello es importante saber cuál de los dos uno está tratando con anticipación. La identidad de los lípidos de alojamiento y el precipitante utilizado son importantes a este respecto, y la apariencia física de los bolo mesofase en la cristalización bien se puede utilizar para distinguirlos (Figura 3). La recolección de los dos tipos de mesofase se ilustra en este artículo.
La recolección de pequeños cristales de una mesofase lipídico en placas intermedias de vidrio es un proceso laborioso que requiere tiempo, habilidad, experiencia, paciencia y una mano firme. Es importante dejar de lado una cantidad adecuada de tiempo para la cosecha y para establecer el laboratorio de forma que todos los suministros y equipos están a la mano de antelación. Una segunda persona para ayudar con la cosecha no es esencial, pero es recomendable. Esa persona puede ayudar con el suministro de pre-marcadas placas para el individuo que hace la recolección, así como la colocación de la crio-enfriados lazos montados con cristales recogidos en el disco de almacenamiento. El asistente también puede desempeñar un papel de apoyo importante en la documentación de las observaciones hechas en los cristales durante la cosecha que podría resultar crucial durante la recolección de datos de difracción. En ausencia de un asistente, un activada por la voz de audio de grabación de dispositivo podría ser utilizado con ventaja para la documentación.
Siguiendo el protocolo descrito en este artículo le ayudará a obtener el Visor de marcha con la cosecha cristal. Sin embargo, es importante apreciar que el proceso no es sencillo y que practice se necesita antes de lanzarse a cosechar valiosos cristales de proteínas de membrana. Se recomienda por lo tanto que las placas de prueba con cristales de proteínas que no son particularmente valiosos se experimentó con primero. Esto proporcionará al neófito con una valiosa experiencia en el corte de vidrio, la eliminación de fragmentos de vidrio, levantando el cubreobjetos encima de la mesofase, usando la característica de polarización en el microscopio para observar cristales y seguirles la pista durante la cosecha y, finalmente, el manejo de los diferentes tipos de mesofases y la cosecha de los mismos. La textura de la mesofase, y por extensión la facilidad con la que los cristales pueden ser cosechadas, cambia con el tiempo durante la cristalización. Es importante por lo tanto para practicar la cosecha con cristales de menor valor, pero con los que han crecido en las mismas condiciones como las más valiosas. Es posible hacer crecer cristales de lisozima y taumatina por el método en meso o lipídica fase cúbica 28 y estos deben ser consiEred a modo de ganar familiaridad con los materiales y el método. También se debe considerar trabajar con sin proteínas mesofase primeros en aprender de sus caprichos.
Los procedimientos demostrados aquí se han realizado a un cómodo 20 ° C o menos. Es posible hacer crecer cristales por el método de meso a temperaturas más bajas. Así, monooleína como el lípido de alojamiento en un estado de fase metaestable puede ser utilizado a 4 ° C 1,2,29,30. Una alternativa es utilizar el diseño racional 7,9 MAG para la cristalización a baja temperatura 31. Hacemos crysallogenesis baja temperatura de forma rutinaria con ciertas metas de proteínas de membrana. En este caso, el crecimiento de cristales y la cosecha se realiza en una cabina de refrigerador a 4 º C. Trabajar en estas condiciones tiene sus propios desafíos no menos importante de los cuales es la necesidad de atuendo cálido y confortable.
El siguiente paso en el proceso global de determinación de la estructura utilizando crys macromolecularestallography es recoger datos de difracción en cristales recolectados y complemento enfriado como se demuestra en este artículo. En meso-grown cristales son generalmente pequeñas. Sin embargo, la difracción útil recogida de datos ha sido posible con los cristales que tienen una dimensión máxima de 20 micras 9. Para este propósito, micro-haz sincrotrón radiación X se usa y es el foco de un artículo JoVE separado en esta serie 32,33.
The authors have nothing to disclose.
Hay muchas personas que contribuyeron a este trabajo y la mayoría son de la membrana Caffrey Estructural y Funcional Grupo de Biología, ambos miembros pasados y presentes. A todos, y especialmente a Jingquan Tan y Lyons Joseph, extendemos nuestro más sincero agradecimiento y reconocimiento. Este trabajo fue apoyado en parte por subvenciones de la Science Foundation Ireland (07/IN.1/B1836), los Institutos Nacionales de Salud (GM75915, P50GM073210 y U54GM094599), y COST 7PM y las Acciones Marie Curie (CM0902 y PIEF GA-2009- -235.612).
Name of reagent | Company | Catalogue number | Components |
Curved tweezers | Sigma | F4142 | Tool |
Disposable pipette tips | Gilson | Various | Disposable |
Foam dewar | Spearlab | FD-500 | Tool |
Glass and metal waste containers | Daniels Healthcare | DD479OL | Tool |
Harvesting loops | MiTeGen | Various | Tool |
Harvesting microscope | Nikon | SMZ1500 | Tool |
Lab notebook | Various | NA | Tool |
Magnetic push button sample loading wand | Hampton Research/Molecular Dimensions | HR4-729/MD7-411 | Tool |
Original Puck (for use with ALS-style robots only) | Crystal Positioning Systems | CP-111-035 | Tool |
Pipetting devices | Gilson | Various | Tool |
Precipitant solutions | Various | Various | Reagent |
Puck Bent Cryo-Tong | Crystal Positioning Systems | CP-111-030 | Tool |
Puck Shelved Shipping Cane (original ALS-style) with hooked handle and locking rod | Crystal Positioning Systems | CP-111-029 | Tool |
Purified water | Millipore | Reagent | |
Safety goggles | Various | NA | Tool |
Sample Pin Bases – Magnetic (non-copper) | Crystal Positioning Systems | CP-111-015 | Tool |
Shipping dewar | Taylor-wharton | CX100 | Tool |
Tissues | NA | NA | Disposable |
Tungsten-carbide glass cutter (TCT Scriber) | Silverline Tools (Yeovil, UK) | 633657 | Tool |