Генерация органотипической культур Плот из первичных кератиноцитов человека
Summary
<em> В пробирке</em> Способ имитировать<em> В естественных условиях</em> Дифференциации эпителиальных описано. Многие вирусы целевой эпителиальных клеток, как часть их жизненного цикла вируса, и этот метод является средством изучения вируса: множество взаимодействий, больше напоминает то, что происходит<em> В естественных условиях</em>. Этот метод может быть использован с первичным кератиноцитов, установленных клеточных линий, а также нормальное или больных биопсия тканей.
Abstract
Развитие культуры эпителиальных органотипической плот предоставил исследователям эффективным в пробирке системы, которая точно повторяет эпителиальной дифференцировки. Есть много применений для этой системы. Например, способность к росту трехмерных органотипической культуры плот кератиноцитов было важной вехой в изучении вируса папилломы человека (ВПЧ) 1. Жизненный цикл вируса папилломы человека тесно связана с дифференциацией плоского эпителия 2. Органотипической эпителиальных культуры плот, как показано здесь воспроизводить весь жизненный цикл вируса папилломы, в том числе вирус производства 3,4,5. Кроме того, эти культуры обладают плот диспластических поражений аналогичных тем, которые наблюдаются на в естественных условиях заражение ВПЧ. Таким образом, эта система также может быть использована для изучения клетки эпителиального рака, а также влияние препаратов на эпителиальной дифференцировки клеток в целом. Первоначально разработанная Asselineau и Prunieras <sдо> 6 и изменены Копан и соавт. 7 органотипической эпителиальных системе культуры плот созрел в общем, довольно легко культура модель, которая предполагает рост клеток в коллаген подключается поддерживается на воздухе жидкость (рис. 1А). В течение 10-14 дней, клетки стратификации и дифференцироваться, образуя полный эпителия толщины, которая производит дифференциацию конкретных цитокератины. Собранные плоты могут быть гистологическое исследование, а также стандартного набора молекулярных и биохимических методов. В этой статье мы опишем метод для генерации плот культур первичных человеческих кератиноцитов. Та же методика может быть использована с установленными эпителиальных клеточных линий, а также может быть легко адаптирована для использования с эпителиальной ткани от нормальных или больных биопсия 8. Многие вирусы цель либо кожной или эпителия слизистой оболочки, как часть их жизненного цикла репликативной. За последние несколько лет, возможности использования органотипической культ плотUres как метод изучения вирус-хозяин взаимодействия клетка была показана несколько вирусов герпеса, а также аденовирусы, парвовирусов и poxviruses 9. Органотипической культуры плот Таким образом, можно адаптировать для изучения вирусного патогенеза, и являются единственным средством для тестирования нового средства против тех вирусов, которые не обрабатываемых в постоянных клеточных линий.
Protocol
Discussion
Здесь мы опишем метод, который может быть использован для изучения дифференциации эпителиальных в целом, но также может быть легко адаптирована для изучения вирусного патогенеза, а также эффективности потенциальных лекарственных препаратов. Многие вирусы целевой эпителиальных клет?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить Салли Робертс (Университет Бирмингема, Бирмингем Великобритания) за любезное дар E1E4 антител. Эта работа была поддержана грантом Национального института рака (4R00CA137160-03).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number |
| Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 |
| DMEM without NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 |
| NaHC03 | Sigma | S5761 |
| Hepes | Calbiochem | 391338 |
| Stainless Steel metal grids | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S |
| E medium11 | ||
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354010 |
References
- Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of ‘simplified’ skin: control of fabrication. The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).
- Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. . Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).
- Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes. Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).
- Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF. Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).
- Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).
- Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).
- Longworth, M. S., Laimins, L. A. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia. Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).
- Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation. Science. 257, 971-973 (1992).
- Wilson, R., Laimins, L. A. . Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).
- zur Hausen, H. Papillomavirus infections–a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).
