Genereren van organotypische Raft Culturen van primaire humane keratinocyten
Summary
Een<em> In vitro</em> Methode om na te bootsen<em> In vivo</em> Epitheliale differentiatie beschreven. Veel virussen richten op epitheliale cellen als onderdeel van hun virale levenscyclus, en deze methode biedt de mogelijkheid te onderzoeken virus: gastheer interacties die meer lijkt op dat die zich voordoet<em> In vivo</em>. Deze techniek kan gebruikt worden met primaire keratinocyten gevestigde cellijnen, alsmede normale of zieke biopsieweefsel.
Abstract
De ontwikkeling van organotypische epitheliale raft culturen heeft onderzoekers met een efficiënt in vitro systeem dat trouw recapituleert epitheliale differentiatie. Er zijn vele toepassingen van dit systeem. Zo heeft de mogelijkheid om drie-dimensionale organotypische raft culturen van keratinocyten te groeien is een belangrijke mijlpaal in de studie van het humaan papillomavirus (HPV) 1. De levenscyclus van HPV is nauw gekoppeld aan de differentiatie van plaveiselepitheel 2. Organotypische epitheliale raft culturen zoals blijkt hier weer de hele papillomavirus levenscyclus, inclusief antivirusprogramma productie 3,4,5. Bovendien zijn deze raft culturen vertonen dysplastische laesies gelijk aan die waargenomen tijdens het in-vivo-infectie met HPV. Vandaar dit systeem kan ook worden gebruikt om kanker epitheelcellen, alsmede de werking van geneesmiddelen op epitheliale celdifferentiatie in het algemeen te bestuderen. Oorspronkelijk ontwikkeld door Asselineau en Prunieras <sup> 6 en gewijzigd door Kopan et al.. 7, de organotypische epitheliale vlot cultuur systeem is uitgegroeid tot een algemeen, relatief eenvoudig cultuur model, dat de groei van cellen gaat op de collageen-stekkers gehandhaafd op een lucht-vloeistof interface (figuur 1a). In de loop van 10-14 dagen, de cellen stratificeren en differentiëren, die een volledige dikte epitheel dat differentiatie-specifieke cytokeratines produceert. Geoogst vlotten kan histologisch worden onderzocht, en door standaard moleculair en biochemische technieken. In dit artikel wordt beschreven een methode voor het genereren van vlot culturen van primaire humane keratinocyten. Dezelfde techniek kan worden gebruikt vastgesteld epitheliale cellijnen en kan gemakkelijk worden aangepast voor gebruik met epitheelweefsel van normale of zieke biopten 8. Veel virussen doel ofwel de cutane of mucosale epitheel als onderdeel van hun replicatieve levenscyclus. In de afgelopen jaren is de haalbaarheid van het gebruik organotypische vlot cultgelen als methode bestuderen virus-gastheercel interacties werd tot meerdere herpesvirussen, alsmede adenovirussen, parvovirussen en poxviruses 9. Organotypische raft culturen kan dus worden aangepast aan de virale pathogenese te onderzoeken, en zijn de enige middelen om nieuwe antivirale middelen te testen op de virussen die niet kweekbare in permanente cellijnen.
Protocol
Discussion
Hier beschreven een methode die kan worden gebruikt om epitheliale differentiatie in het algemeen te bestuderen, maar kan ook gemakkelijk worden aangepast aan virale pathogenese, en de effectiviteit van potentiële therapeutische bestuderen. Veel virussen gericht epitheelcellen of als voornaamste van infectie zoals in het geval van HPV of ergens in de virale levenscyclus, zoals bij herpesvirussen. Hoewel groeiende organotypische raft culturen is tijdrovend, de mogelijkheid om trouw herhalen in-vivo-epitheliale …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs willen graag Sally Roberts (Universiteit van Birmingham, Birmingham VK) bedanken voor het soort geschenk van de E1E4 antilichaam. Dit werk werd ondersteund door een subsidie van het National Cancer Institute (4R00CA137160-03).
Materials
| Name of Reagent | Company | Catalog number |
| Rat Tail Collagen type 1 (4-5mg/ml) | BD Biosciences | 354236 |
| DMEM without NaHC03 | Invitrogen | 12100-061 |
| NaHC03 | Sigma | S5761 |
| Hepes | Calbiochem | 391338 |
| Stainless Steel metal grids | Williams and Mettle Co. | CR-03063-040-100-S |
| E medium11 | ||
| Epidermal Growth Factor | BD Biosciences | 354010 |
References
- Andrei, G., Duraffour, S., VandenOord, J., Snoeck, R. Epithelial raft cultures for investigations of virus growth, pathogenesis and efficacy of antiviral agents. Antiviral Research. 85, 431-449 (2010).
- Asselineau, D., Prunieras, M. Reconstruction of ‘simplified’ skin: control of fabrication. The British Journal of Dermatology. 111, 219-222 (1984).
- Bodily, J., Alam, S., Chen, H., Meyers, C. . Organotypic epithelial raft cultures and the study of the natural history of human papillomavirus. , (2006).
- Cheng, S., Schmidt-Grimminger, D. C., Murant, T., Broker, T. R., Chow, L. T. Differentiation-dependent up-regulation of the human papillomavirus E7 gene reactivates cellular DNA replication in suprabasal differentiated keratinocytes. Genes & Development. 9, 2335-2349 (1995).
- Dollard, S. C., Wilson, J. L., Demeter, L. M., Bonnez, W. R., Reichman, C., Broker, T. R., Chow, L. T. Production of human papillomavirus and modulation of the infectious program in epithelial raft cultures. OFF. Genes & Development. 6, 1131-1142 (1992).
- Frattini, M. G., Lim, H. B., Laimins, L. A. In vitro synthesis of oncogenic human papillomaviruses requires episomal genomes for differentiation-dependent late expression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93, 3062-3067 (1996).
- Kopan, R., Traska, G., Fuchs, E. Retinoids as important regulators of terminal differentiation: examining keratin expression in individual epidermal cells at various stages of keratinization. The Journal of Cell Biology. 105, 427-440 (1997).
- Longworth, M. S., Laimins, L. A. Pathogenesis of human papillomaviruses in differentiating epithelia. Microbiology and Molecular Biology Review. 68, 362-372 (2004).
- Meyers, C., Frattini, M. G., Hudson, J. B., Laimins, L. A. Biosynthesis of human papillomavirus from a continuous cell line upon epithelial differentiation. Science. 257, 971-973 (1992).
- Wilson, R., Laimins, L. A. . Differentiation of HPV-Containing Cells Using Organotypic Raft Culture or Methylcellulose. , 119-119 (2006).
- zur Hausen, H. Papillomavirus infections–a major cause of human cancers. Biochimica et Biophysica Acta. 1288, F55-F78 (1996).
