Summary

Inmunofluorescencia ensayo de leptospiras superficie expuesta proteínas

Published: July 01, 2011
doi:

Summary

Un método eficaz para evaluar la superficie de exposición de las proteínas de la leptospirosis se describe. El método está diseñado específicamente para evitar la interrupción de la frágil membrana externa de las células de leptospira. Esta técnica requiere el empleo de varios controles negativos para evaluar la integridad de la membrana externa y la especificidad de la reacción de los anticuerpos.

Abstract

La superficie de las proteínas bacterianas están involucradas en contacto directo con las células huésped y en la absorción de nutrientes del medio ambiente 1. Por esta razón, la localización celular puede ayudar a comprender el papel funcional de las proteínas bacterianas. Localización de la superficie de las proteínas bacterianas es un paso clave hacia la identificación de factores de virulencia que participan en los mecanismos de patogenicidad.

Métodos de fraccionamiento 2.5 membranas leptospira puede ser selectiva para una cierta clase de proteínas de la membrana externa (OMP), como las lipoproteínas vs OMPs transmembrana, y por lo tanto, llevar a errores de clasificación. Esto probablemente es debido a las diferencias estructurales y la forma en que están asociados a la membrana externa. Las lipoproteínas se asocia con membranas a través de una interacción hidrofóbica entre la fracción lipídica N-terminal (tres ácidos grasos) y los fosfolípidos bicapa lipídica 6, 7. Por el contrario, OMPs transmembrana suelen estar integrados en la bicapa lipídica por anfipáticas β-hojas dispuestas en una estructura de barril-como 8, 9. Además, la presencia de una proteína en la membrana externa, no garantiza necesariamente que la proteína o sus dominios están expuestos en la superficie. Espiroquetas membranas externas se sabe que son métodos frágil y por tanto, requiere la participación manipulación suave de las células y la inclusión de proteínas de sub-superficie de control para evaluar la integridad de la membrana externa.

A continuación, presentamos un ensayo de inmunofluorescencia (IFA) para evaluar directamente la exposición de la superficie de las proteínas en las leptospiras intacto. Este método se basa en el reconocimiento de proteínas de la superficie de leptospiras por el antígeno de anticuerpos específicos. En esto, los anticuerpos específicos para OmpL54 10 son detetcted aftero vinculante a los nativos epítopos de la superficie, expuestos. Comparación de la reactividad de anticuerpos frente a células intactas permeabilized permite la evaluación de la distribución de celulares y si una proteína está presente en la superficie de forma selectiva leptospirosis. La integridad de la membrana externa deben ser evaluados utilizando anticuerpos contra una o más proteínas del subsuelo, preferentemente en el periplasma.

El método de la superficie de la IFA se puede utilizar para analizar la exposición de la superficie de cualquier proteína de leptospira a que los anticuerpos específicos disponibles. Tanto la utilidad y las limitaciones del método depende de si los anticuerpos empleados son capaces de unirse a epítopos nativos. Dado que los anticuerpos a menudo se levantan contra las proteínas recombinantes, los epítopos de los nativos, expuestas en la superficie las proteínas no pueden ser reconocidos. Sin embargo, el método de la superficie de IFA es una herramienta valiosa para el estudio de los componentes de la superficie bacteriana intacta. Este método se puede aplicar no sólo para las leptospiras, pero también otras espiroquetas y bacterias gram-negativas. Para conclusiones más sólidas sobre la superficie de exposición de OMP, un enfoque integral que implique a varios métodos de localización celular se recomienda 10.

Protocol

1. La fijación de Leptospira a las diapositivas de cristal Leptospira interrogans es una clase BSL2 patógeno. Trabajar con células vivas que requiere un manejo adecuado, como guantes, bata de laboratorio y medidas de pipeteo en una campana estéril. Crecer Leptospira en EMJH medium11, complementada con suero de conejo al 1% a 30 ° C hasta llegar a mediados o finales de la fase de inicio de sesión (la densidad de 5 x 10 7 5 x 10 8 células / ml) durante aproximadam…

Discussion

La superficie de nuestra técnica de IFA es similar a la utilizada para demostrar la superficie de exposición de los diversos borrelial 15, 16 y leptospirosis 12, 17 proteínas. Los detalles de la superficie, método IFA descritos aquí están diseñados para reducir al mínimo la manipulación de células en un esfuerzo por mantener la integridad de la membrana externa de tiempo que se aprovechan de la tendencia de las células de Leptospira a adherirse a las diapositivas de cristal. El método c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este estudio fue apoyado por el Servicio de Salud Pública de subvención AI-34 431 (a DAH) del Instituto Nacional de Alergias y Enfermedades Infecciosas y VA Fondos de Investigación Médica (a DAH).

Materials

Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
Two-well chamber glass slides Lab-Tek 177380  
Rabbit serum Rockland Immunochemicals D209-00-0100  
Leptospira Enrichment EMJH BD Difco 279510  
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) Invitrogen/Molecular Probes A-11034  
Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) Invitrogen/Molecular Probes A-11029  
4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) Invitrogen/Molecular Probes D1306  
ProLong Gold anti-fade mounting medium Invitrogen/Molecular Probes P36930 Equilibrate to room temperature before use
Fisherfinest Premium Cover Glass Fisher 12-544-14  
Fluorescence microscope Zeiss Axioskop 40  

References

  1. Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
  2. Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
  3. Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
  4. Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
  5. Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
  6. Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
  7. Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
  8. Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  9. Schulz, G., Benz, R. . The structures of general porins. , (2004).
  10. Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
  11. Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
  12. Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
  13. Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
  14. Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
  15. Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
  16. Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
  17. Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).

Play Video

Cite This Article
Pinne, M., Haake, D. Immuno-fluorescence Assay of Leptospiral Surface-exposed Proteins. J. Vis. Exp. (53), e2805, doi:10.3791/2805 (2011).

View Video