חיסונית פלואורסצנציה Assay של משטח חשוף חלבונים Leptospiral
Summary
שיטה יעילה כדי להעריך את פני חשיפה של חלבונים leptospiral מתואר. השיטה היא תוכננה במיוחד כדי למנוע שיבוש של הממברנה החיצונית של התאים leptospiral שביר. טכניקה זו דורשת עבודה של בקרות שלילי מספר להעריך את היושרה של הממברנה החיצונית הספציפיות של תגובת הנוגדנים.
Abstract
חלבונים חיידקיים משטח מעורבים בקשר ישיר עם תאים המארח ספיגת חומרים מזינים מן הסביבה 1. מסיבה זו, לוקליזציה הסלולר יכולים לספק תובנות על תפקיד פונקציונלי של חלבונים חיידקיים. לוקליזציה Surface של חלבונים חיידקיים היא צעד מפתח לקראת זיהוי של גורמים ארסיות מעורבים מנגנונים של pathogenicity.
שיטות fractionating leptospiral 2-5 ממברנות עשוי להיות סלקטיבי לסוג מסוים של הממברנה החיצונית, חלבונים (OMPs), כגון ליפופרוטאינים לעומת OMPs הטרנסממברני, ולכן להוביל misclassification. סביר זאת בשל הבדלים מבניים ואיך הם קשורים אל הממברנה החיצונית. ליפופרוטאינים הקשורים ממברנות באמצעות אינטראקציה הידרופובי בין מחצית N-מסוף השומנים (שלושה חומצות שומן) לבין פוספוליפידים bilayer השומנים 6, 7. לעומת זאת, OMPs הטרנסממברני משולבים בדרך כלל על ידי amphipathic β גיליונות מסודרים במבנה דמוי חבית 8, 9 לתוך bilayer השומנים. בנוסף, הנוכחות של חלבון בקרום החיצוני אינה מבטיחה בהכרח כי חלבון או תחומים שלו חשופים על פני השטח. הקרומים החיצוניים Spirochetal ידועים להיות שיטות שביר ולכן מחייבים מעורבים מניפולציה עדינה של תאים הכללת חלבון משטח משנה שולט על מנת להעריך את שלמות הממברנה החיצונית.
כאן, אנו מציגים assay immunofluorescence (IFA) שיטה ישירות להעריך את החשיפה של חלבונים על פני השטח leptospires ללא פגע. שיטה זו מבוססת על ההכרה של חלבונים פני השטח leptospiral ידי אנטיגן ספציפי לערמונית נוגדנים. בזאת, נוגדנים ספציפיים עבור OmpL54 10 הם detetcted aftero מחייב, epitopes יליד משטח חשוף. השוואה של תגובתיות נוגדנים לתאי שלם לעומת permeabilized מאפשר הערכה של התפלגות סלולרית והאם החלבון מצוי באופן סלקטיבי על פני השטח leptospiral. שלמות של הממברנה החיצונית יש לבחון באמצעות נוגדן אחד או יותר חלבונים מתחת לפני הקרקע, הממוקמת רצוי periplasm.
השיטה משטח IFA ניתן להשתמש כדי לנתח את החשיפה פני השטח של כל חלבון leptospiral שבה נוגדנים ספציפיים זמינים. גם את התועלת והגבלה של השיטה תלויה בשאלה אם הנוגדנים המועסקים מסוגלים להיקשר epitopes הילידים. מאז נוגדנים לעתים קרובות מועלות כנגד חלבונים רקומביננטי, epitopes של הילידים, משטח חשוף חלבונים לא יכול להיות מוכר. עם זאת, שיטת משטח IFA הוא כלי רב ערך ללימוד מרכיבי משטחי חיידקים שלמים. שיטה זו יכולה להיות מיושמת לא רק עבור leptospires אלא גם שהחיידקים אחרים חיידקים גראם שליליים. לקבלת מסקנות חזקה לגבי משטח החשיפה של OMPs, גישה מקיפה הכוללת מספר שיטות לוקליזציה תא מומלץ 10.
Protocol
Discussion
משטח IFA שלנו היא טכניקה דומה לזה המשמש כדי להדגים את חשיפת פני השטח של borrelial שונים 15, 16 ו leptospiral 12, 17 חלבונים. הפרטים של השיטה משטח IFA שתוארו כאן נועדו למזער את המניפולציה של תאים, במטרה לשמור על שלמות הממברנה החיצונית תוך ניצול הנטייה של תאים Leptospira לדבוק שקופ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי השירות לבריאות הציבור מענק AI-34431 (ל DAH) מן המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות VA ועל ידי קרנות מחקר רפואי (כדי DAH).
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
|---|---|---|---|
| Two-well chamber glass slides | Lab-Tek | 177380 | |
| Rabbit serum | Rockland Immunochemicals | D209-00-0100 | |
| Leptospira Enrichment EMJH | BD Difco | 279510 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11034 | |
| Alexa Fluor 488 goat anti-mouse IgG (H+L) | Invitrogen/Molecular Probes | A-11029 | |
| 4’6-diamidino-2-phenyl-indole dihydrochloride (DAPI) | Invitrogen/Molecular Probes | D1306 | |
| ProLong Gold anti-fade mounting medium | Invitrogen/Molecular Probes | P36930 | Equilibrate to room temperature before use |
| Fisherfinest Premium Cover Glass | Fisher | 12-544-14 | |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axioskop 40 |
References
- Achouak, W., Heulin, T., Pages, J. M. Multiple facets of bacterial porins. FEMS Microbiol Lett. 199, 1-7 (2001).
- Haake, D. A., Matsunaga, J. Characterization of the leptospiral outer membrane and description of three novel leptospiral membrane proteins. Infect Immun. 70, 4936-4945 (2002).
- Haake, D. A. Changes in the surface of Leptospira interrogans serovar grippotyphosa during in vitro cultivation. Infect Immun. 59, 1131-1140 (1991).
- Nally, J. E. Purification and proteomic analysis of outer membrane vesicles from a clinical isolate of Leptospira interrogans serovar Copenhageni. Proteomics. 5, 144-152 (2005).
- Zuerner, R. L., Knudtson, W., Bolin, C. A., Trueba, G. Characterization of outer membrane and secreted proteins of Leptospira interrogans serovar pomona. Microb Pathog. 10, 311-322 (1991).
- Cullen, P. A., Haake, D. A., Adler, B. Outer membrane proteins of pathogenic spirochetes. FEMS Microbiol Rev. 28, 291-318 (2004).
- Haake, D. A. Spirochaetal lipoproteins and pathogenesis. Microbiology. 146, 1491-1504 (2000).
- Koebnik, R., Locher, K. P., Gelder, P. V. a. n. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
- Schulz, G., Benz, R. . The structures of general porins. , (2004).
- Pinne, M., Haake, D. A. A comprehensive approach to identification of surface-exposed, outer membrane-spanning proteins of Leptospira interrogans. PLoS One. 4, e6071-e6071 (2009).
- Johnson, R. C., Rogers, P. Metabolism of leptospires. II. The action of 8-azaguanine. Can J Microbiol. 13, 1621-1629 (1967).
- Cullen, P. A. Surfaceome of Leptospira spp. Infect Immun. 73, 4853-4863 (2005).
- Haake, D. A. Molecular cloning and sequence analysis of the gene encoding OmpL1, a transmembrane outer membrane protein of pathogenic Leptospira spp. J Bacteriol. 175, 4225-4234 (1993).
- Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., Akins, D. R. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun. 70, 3468-3478 (2002).
- Noppa, L., Östberg, Y., Lavrinovicha, M., Bergström, S. P13 an integral membrane protein of Borrelia burgdorferi, is C-terminally processed and contains surface-exposed domains. Infect Immun. 69, 3323-3334 (2001).
- Parveen, N., Leong, J. M. Identification of a candidate glycosaminoglycan-binding adhesin of the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 35, 1220-1234 (2000).
- Ristow, P. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3, e97-e97 (2007).
